桂科豬主要免疫指標(biāo)測定與初步分析

蘇乾蓮 梁家幸 李斌 周英寧 陳忠偉 謝炳坤 閉炳芬 秦毅斌 盧冰霞 何穎 段群棚 盧敬專 蔣冬福 潘天彪 趙武*

(1，廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001；2，廣西畜牧研究所530001)

桂科豬是由廣西畜牧研究所利用廣西優(yōu)良本地品種陸川豬作為母本與杜洛克作為父本培育出來的一個新的配套系豬種，兼具本地豬肉質(zhì)鮮美和外來豬生長速度快雙重優(yōu)點(diǎn)[1]。機(jī)體抗病力一般受先天免疫和后天免疫所協(xié)調(diào)。先天性免疫快速，無特異性，是防御的第一線，主要與嗜中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、補(bǔ)體、干擾素和急性蛋白因子有關(guān)。后天性免疫涉及到淋巴細(xì)胞 (如T細(xì)胞、B細(xì)胞)，通過獨(dú)特的遺傳機(jī)理產(chǎn)生特殊的抗原反應(yīng)。二者通過直接與細(xì)胞接觸或通過包括化學(xué)介質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子相互作用[2]。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，是機(jī)體內(nèi)特異高效調(diào)控免疫細(xì)胞和協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答最重要的信號分子，可髙效調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)、移植排斥反應(yīng)和造血功能等，并且在各類具有免疫活性細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟和活化中起著十分重要的控制作用[3]。

Th細(xì)胞主要分為Th1和Th2兩個亞類，通過產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞因子，達(dá)到Th1/Th2平衡[4]。Th1細(xì)胞遷移入感染位點(diǎn)并分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-β，促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并可抵御病毒等胞內(nèi)病原體。Th2細(xì)胞促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，其刺激B細(xì)胞增殖、抗體分泌及抗體類別轉(zhuǎn)換為IgE和IgA，它們分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13[5]。白細(xì)胞介素-2（IL-2）又稱T淋巴細(xì)胞生長因子（TCGF)，在分裂素或特異性抗原刺激作用下，主要由活化的輔助性T淋巴細(xì)胞（CD4+和CD8+)分泌產(chǎn)生，還可由T細(xì)胞瘤細(xì)胞和一些前T細(xì)胞、前B細(xì)胞產(chǎn)生，甚至自然殺傷性細(xì)胞（NK)和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK)也可產(chǎn)生[6]。白細(xì)胞介素-4（IL-4）是由抗原或有絲分裂原誘導(dǎo)Th2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子[7]。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，主要是抑制Th1細(xì)胞的分泌，也可刺激效應(yīng)B細(xì)胞的增殖分化，并且能產(chǎn)生抗體，具有雙向調(diào)節(jié)作用[8]。 γ-干擾素（IFN-γ)是由病毒或其他干擾素（IFN)誘生劑刺激使人或動物活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的一類高活性、多功能的生物活性糖蛋白，屬于Th1型細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，對細(xì)胞免疫和體液免疫具有放大作用[9]。IL-2等免疫指標(biāo)可作為抗病育種的間接指標(biāo)，通過評估免疫指標(biāo)是選育提高動物抗病性的一條有效、可行的途徑[10]。本試驗(yàn)以桂科豬作為試驗(yàn)對象，對其主要免疫指標(biāo)進(jìn)行測定與初步分析，試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑盒及疫苗

Procine IL-2 ELISA KIT 96T、Procine IL-4 ELISA KIT 96T、Procine IL-10 ELISA KIT 96T、Procine IFN-γ ELISA KIT 96T均購自上海研晶生物科技有限公司，Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit購自美國IDEXX公司。豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）購自中牧實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動物

本次試驗(yàn)采用廣西畜牧研究所桂科豬育種場提供的2014年10月1日出生的19頭健康桂科育成豬和2014年10月9日出生的22頭健康桂科育成豬，體重在35～60kg，對豬群進(jìn)行連續(xù)7次采血，7周齡開始，每周1次直至13周齡。

1.3 血樣采集

采血前禁食12h，記錄豬只性別、編號、免疫情況。前腔靜脈采集血液3ml放入無抗凝劑的離心管中，并標(biāo)記相應(yīng)的編號，直接送回本實(shí)驗(yàn)室制備血清。

1.4 細(xì)胞因子測定

血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量采用ELISA法進(jìn)行測定，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 抗體檢測

根據(jù)豬瘟疫苗二免時(shí)間每批豬選擇5個時(shí)間點(diǎn)的血清，用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測試劑盒對桂科豬血清中的特異性豬瘟病毒抗體進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析作圖

原始數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步分析，采用SPSS19.0版進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)性分析。用Graphpad軟件對阻斷值做圖并分析豬瘟抗體消長規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子測定結(jié)果

由表1顯示，IL-2在第10周與第1周差異顯著（p＜0.05），第11、12、13周分別與第7、8、9、10周差異極顯著（P＜0.01）；IL-4在第8、11周分別與第9周差異顯著（p＜0.05），第12、13周分別與第8、11周差異顯著（p＜0.05），第7、12、13周分別與第9、10周差異極顯著（p＜0.01），第8、11周分別與第10周差異極顯著（p＜0.01）；IL-10在第12周分別與第11、13周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、8、9、10周差異極顯著（p＜0.01），第11、13周分別與第8周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、9、10周差異極顯著（p＜0.01）；IFN-γ在第12周與第11周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、8、9、10周差異極顯著（p＜0.01），第13周分別與第9、10周差異顯著（p＜0.05）。

圖1 IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值變化曲線

表1 細(xì)胞因子測定結(jié)果（單位：ng/L）

表2 不同免疫指標(biāo)不同時(shí)間段相關(guān)性分析結(jié)果

2.2 免疫指標(biāo)測定結(jié)果分析

由表2可知，7～10周，血清中IFN-γ與IL-2呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與IL-4呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）；IL-4與IL-2呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）。10～12周，IL-4與IL-2呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）；IL-10與IL-2呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），與IL-4呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。12～13周，IFN-γ 與IL-2呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與IL-4呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與IL-10呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）；IL-4與IL-2呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；IL-10與IL-2呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與IL-4呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）。由圖1可知，IL2+IFN-γ與IL-4+IL-10的比值在約第10周齡達(dá)最小值，在約第13周齡恢復(fù)到原來比值。

2.3 豬瘟抗體檢測結(jié)果分析

兩批豬豬瘟疫苗首免時(shí)間皆為22日齡，加強(qiáng)免疫時(shí)，第一批豬在70日齡進(jìn)行，第二批豬在62日齡進(jìn)行，兩批豬加強(qiáng)免疫后豬瘟抗體水平皆比首免后第一次采樣血清中的抗體水平有一定程度的提高。樣本阻斷率與抗體水平呈正相關(guān)，豬瘟抗體消長趨勢如圖2和圖3。

3 討論

圖2 第一批桂科豬豬瘟抗體消長趨勢

圖3 第二批桂科豬豬瘟抗體消長趨勢

IL-2能維持和促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖與分化，增強(qiáng)單核細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK)和γ-干擾素的產(chǎn)生及多種細(xì)胞因子受體表達(dá)，還可以增加抗原遞呈細(xì)胞表面MHCI類分子和MHCII類分子的數(shù)量，增強(qiáng)抗原遞呈作用，促進(jìn)免疫球蛋白（IgM和IgG)的分泌[6]。IL-4具有重要的免疫功能，可增強(qiáng)B細(xì)胞和T細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，尤其是IgE的分泌，還可誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞表達(dá)MHCII類分子，增強(qiáng)其抗原遞呈能力，改善造血細(xì)胞的增殖與分化，誘導(dǎo)CD4+Th幼稚前體細(xì)胞定向分化為Th2型細(xì)胞，抑制Thl細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，是Th2細(xì)胞分泌的自我調(diào)節(jié)生長因子，對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用[7]。IL-4可以抑制NK細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，并抑制其進(jìn)一步聚集和活化、抑制蛻膜NK細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，從而阻斷NK細(xì)胞活性及其對滋養(yǎng)層的損傷[11]。IL-10能抑制Th1細(xì)胞源性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 和 Th2細(xì)胞源性細(xì)胞因子IL-4、IL-5的產(chǎn)生，還能通過抑制T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2直接影響T細(xì)胞的分化和增殖，但I(xiàn)L-10能提高抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞表面高親和力IL-2受體過表達(dá)[12]。IFN-γ具有廣譜抗病毒活性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，對多種病毒均有抑制作用，能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞、K細(xì)胞的殺傷活性，增強(qiáng)組織相容抗原和某些受體的表達(dá)，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷和吞噬能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，抑制病毒在新感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，還可通過刺激抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子增強(qiáng)機(jī)體的獲得性免疫反應(yīng)，利于向殺傷性T細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解，通過特異性CTL加速病毒的清除[9]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示IL-2在第10周分別與11、12、13周差異極顯著（P＜0.01），與第1周差異顯著（p＜0.05）；IL-4在第10周分別與7、8、11、12、13周差異極顯著（p＜0.01）；IL-10在第10周分別與11、12、13周差異極顯著（p＜0.01）；IFN-γ在第10周與第11周差異極顯著（p＜0.01），與第13周差異顯著（p＜0.05）。注射豬瘟疫苗后對Th1/Th2有直接的影響，IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值在約第10周齡達(dá)最小值，注射疫苗兩周后達(dá)最高并很快恢復(fù)到原來比值。7～13周，血清中IL-2經(jīng)歷了先減少后增加的變化，IL-4經(jīng)歷了先增加后減少的變化，IL-10、IFN-γ經(jīng)歷了不同程度的先增加后減少再增加的變化，彼此間的相關(guān)性也處在動態(tài)變化中。IFN-γ與IL-2的相關(guān)性從極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）到無顯著相關(guān)再到極顯著正相關(guān)（p＜0.01）；IFN-γ與IL-4的相關(guān)性從極顯著正相關(guān)（p＜0.01）到無顯著相關(guān)再到極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）；IFN-γ與IL-10的相關(guān)性從無顯著相關(guān)到極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。IL-4與IL-2由極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）到顯著正相關(guān)（p＜0.05）再到極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）。注射豬瘟疫苗會影響細(xì)胞因子分泌和特異性抗體的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。

4 結(jié)論

綜上結(jié)果表明，桂科豬這一新的配套系豬種有良好的免疫系統(tǒng)和免疫功能，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為開發(fā)有特色的商品豬生產(chǎn)模式疫病防控提供科學(xué)依據(jù)。