3種野生越桔屬植物漿果提取物抗氧化活性比較研究

王 化，李夢莎，何丹嬈，朱良玉，周麗萍*

（黑龍江省科學院 自然與生態(tài)研究所 林下經(jīng)濟資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

越桔屬（Vaccinium）植物是杜鵑花科（Ericaceae）灌木或小喬木，葉常綠、少數(shù)落葉，主要分布北半球溫帶、亞熱帶、美洲和亞洲的熱帶山區(qū)[1]；漿果球形，果實顏色為紅色、藍黑色或紫色，營養(yǎng)豐富，含糖、多種維生素、有機酸、花色苷、礦物質(zhì)等，深受廣大消費者喜愛[2-3]。篤斯越桔（Vaccinium uliginosum Linn.）、越桔（Vaccinium vitis-idaea Linn.）和歐洲越桔（Vaccinium myrtillus Linn.）是北半球高緯度地區(qū)的3種重要林下經(jīng)濟植物[4]，分布廣泛，野生果實富含天然抗氧化成分，蘊儲量大。目前果實主要用于鮮食、生產(chǎn)食品、天然色素、飲料和釀酒，少量用于提取物生產(chǎn)。隨著對天然抗氧化劑生理功能研究的不斷深入[5-6]，以花色苷、有機酸為主要成分的越桔提取物需求量不斷增大，市場前景廣闊。篤斯越桔、越桔和歐洲越桔3者漿果提取物的比較研究鮮見報道。本實驗通過對3種漿果花色苷和多酚類物質(zhì)含量測定及體外抗氧化活性比較，以期為北半球高緯度地區(qū)野生越桔屬漿果資源的開發(fā)及綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越桔、越桔：收集于大興安嶺地區(qū)塔河縣；歐洲越桔：收集于芬蘭赫爾辛基。

XDA-6樹脂：南開大學樹脂廠；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸（vitamin C，VC）：美國Sigma公司；福林-酚試劑Ⅱ：天津市光復(fù)精細化工研究所；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、水楊酸鈉、硫酸亞鐵等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-110電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；S-3L pH計：上海精密儀器有限公司；UV-Vis EVO300分光光度計：美國Thermo公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-5200超聲波提取儀：北京益植康生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

采用超聲波輔助提取工藝提取，提取液為體積分數(shù)70%的乙醇，料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度40 ℃，提取時間30 min，提取2次，合并提取液。提取液48℃減壓濃縮后凍干得到3種漿果的粗提物，分別標記為H（越桔粗提物）、D（篤斯越桔粗提物）、O（歐洲越桔粗提物）。

1.3.2 純化方法

采用柱層析法對漿果提取物進行分離純化，通過固定相介質(zhì)篩選和流動相介質(zhì)優(yōu)化，確定了分離的固定相介質(zhì)為XDA-6型介質(zhì)，依次以蒸餾水、10%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液為流動相進行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，每種漿果得到3個分離純化組分（純化1組：10%乙醇水溶液；純化2組：30%乙醇水溶液；純化3組：50%乙醇水溶液），減壓濃縮凍干后一共得到9種漿果純化物，分別標記為H-1（越桔10%乙醇提取物）、D-1（篤斯越桔10%乙醇提取物）、O-1（歐洲越桔10%乙醇提取物）；H-2（越桔30%乙醇提取物）、D-2（篤斯越桔30%乙醇提取物）、O-2（歐洲越桔30%乙醇提取物）；H-3（越桔50%乙醇提取物）、D-3（篤斯越桔50%乙醇提取物）、O-3（歐洲越桔50%乙醇提取物）。

1.3.3 花色苷含量測定方法

各組提取物中花色苷含量以pH示差法[7-8]進行測定。

不同pH值溶液的配制方法：

pH 1.0：0.2mol/LHC1∶0.2mol/LKCl=67∶25（V/V）；

pH 4.5：0.2mol/LHAc∶0.2mol/LNaAc·3H2O=1∶1，（V/V）。

使用移液器吸取供試樣品配制的溶液2 mL，以pH1.0及pH4.5緩沖液進行稀釋，至一定倍數(shù)混勻。用2 mL溶劑作為空白組，于波長510 nm和700 nm處分別測定吸光度值，每份供試樣品3次平行操作。

花色苷含量（以矢車菊素-3-葡萄糖苷計）計算公式如下：

式中：ACY為花色苷含量，mg/mL；Mw為Cya-3-glu的摩爾分子質(zhì)量（449.2）；DF為稀釋倍數(shù)；26 900為Cya-3-glu的摩爾消光系數(shù)；L為光程，1 cm。

1.3.4 多酚含量測定方法

多酚類物質(zhì)含量測定采用Folin-Ciocalteu法[9]，準確加入1 mL供試樣品溶液于25 mL納氏比色管內(nèi)，然后依次加入50%福林-酚顯色劑1 mL、7.5%碳酸鈉溶液3 mL和蒸餾水5 mL，加蓋后振蕩、搖勻、避光，2 h后以分光光度計測定波長765 nm處的吸光度值，計算總多酚含量，每份供試樣品3次平行操作。

以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，沒食子酸質(zhì)量濃度（x）作為橫坐標，吸光度值（y）作為縱坐標，線性回歸方程：y=0.011 3x+0.008 1（R2=0.998 9）。

1.3.5 總還原能力測定方法

總還原能力參照文獻[10-11]略有改動。準確量取質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的供試樣品溶液0.5 mL于25 mL納氏比色管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH為6.6）2.5 mL，混勻后加入1%K3Fe（CN）6溶液2.5 mL?；靹颍囟?0℃，保持20 min，之后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL。充分振蕩混合后1 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL加入比色管中，然后加入蒸餾水5 mL，0.1%的FeCl3溶液1 mL，混勻后以分光光度計測定波長700 nm處的吸光度值，記為A1；用蒸餾水代替不同濃度的供試樣品溶液，同法操作測定吸光度值，記為A0。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對照品?？傔€原力計算公式如下：

式中：m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 羥自由基清除能力測定方法

實驗方法參照文獻[12]略有改動，進行測定。反應(yīng)體系由以下試劑混合組成：0.5 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，0.8 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，0.5 mL蒸餾水，供試樣品溶液1.0 mL，0.2 mL 20 mmol/L水楊酸鈉溶液，共3.0 mL。將該反應(yīng)體系混合均勻后，37℃水浴溫育1 h，取出于波長510 nm處測定混合物吸光度值A(chǔ)1；將上述體系中的1.0 mL供試樣品溶液以蒸餾水替代，同法操作，測定吸光度值A(chǔ)0；將上述體系中0.2 mL水楊酸鈉溶液用相同體積的蒸餾水代替，其余同法操作，測定吸光度值A(chǔ)2。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對照品。按照下面公式計算羥自由基清除率：

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定方法

按照BLOIS MS等[13]的方法測定供試樣品對DPPH自由基的清除作用。精確稱量DPPH試劑粉末，臨用前于棕色瓶中配制濃度為8.62×10-2mmol/L的DPPH乙醇溶液，向試管中加入DPPH試劑2.0 mL，不同供試樣品溶液2.0 mL，混合均勻，避光放置30 min，于波長517 nm處測定混合物的吸光度值A(chǔ)1；同法操作，用2.0 mL乙醇代替供試樣品，測定吸光度值A(chǔ)0；不加DPPH溶液，用2.0 mL乙醇代替，加入不同濃度供試樣品溶液，同法操作測定吸光度值A(chǔ)2。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對照品。通過如下公式計樣品對DPPH自由基的清除能力：

1.3.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)均采用x±s表示，檢查方差齊性，組間比較采用最小顯著性差異法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性成分含量檢測結(jié)果與分析

2.1.1 花色苷含量

3種漿果的純化產(chǎn)物共9個樣品的花色苷含量如圖1所示。

圖1 3種漿果純化提取物花色苷含量Fig.1 Anthocyanins contents in the purified extracts of three kinds of berries

由圖1可知，篤斯越桔和歐洲越桔各提取物組分中花色苷含量均極顯著（P＜0.01）高于越桔各提取物組分，歐洲越桔O-1、O-2、O-3組的花色苷含量均略高于篤斯越桔相應(yīng)各組，O-3中花色苷含量（9.34±0.38%）低于D-3（9.42±0.26%），但差異不顯著（P＞0.05）。各純化組分中花色苷含量依次為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物，各組間差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2 總多酚類物質(zhì)含量

3種漿果的純化產(chǎn)物共9個樣品的總多酚類物質(zhì)含量如圖2所示。

圖2 3種漿果純化提取物總多酚類物質(zhì)含量Fig.2 Total polyphenols contents in the purified extracts of three kinds of berries

由圖2可知，結(jié)合花色苷含量結(jié)果分析，可見篤斯越桔和歐洲越桔中多酚類物質(zhì)以花色苷為主，越桔中則相反；越桔中除花色苷以外的多酚類物質(zhì)含量高于篤斯越桔和歐洲越桔。不同純化組分間多酚含量也存在較大差異（P＜0.05），越桔純化組分中總多酚含量依次為30%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物，而篤斯越桔和歐洲越桔為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物。差異形成原因主要是越桔提取物中以酚酸為主，極性相對較低。3種漿果的純化產(chǎn)物中均為30%乙醇洗脫物的總多酚類物質(zhì)含量最高，O-2（（35.86±0.33）%）＞D-2（（33.32±0.59）%）＞H-2（（27.96±0.48）%）。

2.2 體外抗氧化活性檢測結(jié)果與分析

2.2.1 清除羥自由基活性

羥自由基有極強的氧化能力即得電子能力，是自然界一種重要的活性氧。通過殘留的羥自由基與水楊酸之間相互作用，產(chǎn)生的2,3-二羥基苯甲酸在波長510 nm處有特征吸收峰，3種漿果純化提取物對羥基自由基的清除作用如圖3所示。

圖3 3種漿果純化提取物的羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rates of the purified extracts of three kinds of berries

由圖3可知，3種漿果各組提取物均有較好的羥自由基清除活性，各提取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，O-2（（93.22±1.39）%）和D-2（（91.04±1.26）%）羥自由基清除率最高，顯著高于VC（（87.52±2.04）%）（P＜0.05），O-0最低，僅為（45.57±0.78）%。H-2的抗氧化活性也高于其他純化組，表明3種漿果的30%乙醇洗脫物具有最好的清除羥自由基能力，這與3種漿果的30%乙醇洗脫物中花色苷和多酚含量最高的檢測結(jié)果有較好的一致性。

2.2.2 清除DPPH自由基活性

DPPH乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm處有強烈吸收，是一種穩(wěn)定的以N為中心的質(zhì)子自由基，當清除劑存在時，其提供的電子與DPPH孤對電子配對而導致其褪色，褪色程度與接受電子量呈定量關(guān)系[14]，因而用分光光度計對3種漿果提取物清除DPPH自由基活性進行定量分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 3種漿果純化提取物的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rates of the purified extracts of three kinds of berries

由圖4可知，各提取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，O-2、D-2、O-3的DPPH自由基清除率分別為（98.09±1.54）%、（97.63±1.65）%、（97.31±1.23）%，表明3者的抗氧化能力很強，幾乎清除了體系內(nèi)所有的自由基，3者間差異不顯著（P＞0.05）。O-1、O-2、O-3、D-1和D-2清除DPPH自由基的能力均高于VC，H-2和H-3組的活性與VC相當，差異不顯著（P＞0.05）。另外，H-1和H-2的清除能力低于相應(yīng)篤斯越桔和歐洲越桔各組純化產(chǎn)物，但在50%乙醇洗脫物組中，清除活性為O-3＞H-3＞D-3，越桔組優(yōu)于篤斯越桔組，H-3組中豐富的酚酸類物質(zhì)起到了較好的作用。

2.2.3 總還原能力

還原能力是衡量抗氧化能力的重要指標，具有還原性的物質(zhì)可以發(fā)生氧化反應(yīng)，從而保護其他物質(zhì)，達到抗氧化的目的。當體系中存在還原性物質(zhì)時，鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍，于波長700 nm處有最大吸收峰。每克提取物干物質(zhì)的總還原力如圖5所示。

圖5 3種漿果純化提取物的總還原力Fig.5 The total reducing power of the purified extracts of three kinds of berries

由圖5可知，篤斯越桔和越桔各組提取物還原能力為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物，而歐洲越桔為30%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物，但總還原能力最高為歐洲越桔的30%乙醇洗脫物，與清除羥自由基和DPPH自由基檢測結(jié)果相一致。

與篤斯越桔和歐洲越桔相比，越桔的花色苷含量較少，但其他酚酸類物質(zhì)含量較多[15-16]，因此越桔提取物的總還原能力同樣很強，相比于歐洲越桔和篤斯越桔較高的原料價格，越桔提取物可以憑借其較好的抗氧化能力和較低的價格贏得更多地消費市場。

2.3 活性成分含量與體外抗氧化結(jié)果相關(guān)性分析

3種漿果中花色苷和多酚類物質(zhì)與抗氧化指標（總還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率）之間的相關(guān)性分析見圖6。

圖6 3種漿果中活性成分與抗氧化指標之間的相關(guān)性Fig.6 Correlation between active components in three kinds of berries and antioxidant indexes

由圖6可知，多酚類物質(zhì)含量與3種抗氧化指標間的相關(guān)性高于花色苷，總還原力與各組提取產(chǎn)物多酚類物質(zhì)含量線性關(guān)系方程的R2最高，為0.905，可見漿果提取物中多酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力相關(guān)性極好，可以用于此類提取物質(zhì)量檢測的參考指標。

3 結(jié)論

通過對3種野生越桔屬植物漿果提取物花色苷和多酚類物質(zhì)含量測定及抗氧化活性比較研究，綜合分析結(jié)果表明，越桔、篤斯越桔和歐洲越桔3種漿果的9種純化組分中，篤斯越桔和歐洲越桔30%乙醇洗脫物組分的抗氧化活性最強，總還原力分別為（1 197.4±25.93）/g和（1 237.5±27.13）/g，與VC（1219.1±32.62）/g無顯著差異（P＞0.05）；DPPH自由基清除率分別為（97.63±1.65）%和（98.09±1.54）%，高于VC（（86.66±1.84）%）和越桔（（86.68±2.39）%）；羥自由基清除率分別為（91.04±1.26）%和（93.22±1.39）%，高于VC（（87.52±2.04）%）和越桔（（81.80±1.23）%）?？傮w分析，篤斯越桔與歐洲越桔抗氧化活性相近，篤斯越桔和歐洲越桔抗氧化活性高于越桔。