MSN4基因的過(guò)表達(dá)對(duì)釀酒酵母耐受性的影響研究

董勝勝，李 瀟，王鵬飛，付肖蒙，肖冬光，董 健*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

酵母多數(shù)普遍存在于富含糖類的環(huán)境（如水果、蔬菜、花蜜和植物分泌物中，以及果園和部分富含石油的土壤）中。目前最常見(jiàn)且應(yīng)用最為廣泛的酵母菌種當(dāng)屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母是一種單細(xì)胞真核微生物，形態(tài)多為球形、橢圓形、卵圓形及臘腸形，其個(gè)體大小也會(huì)隨菌種的不同而有所差異[1]，但比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大的多，一般為1～5 μm或5～20 μm，其細(xì)胞的長(zhǎng)寬比例為1～2左右。而溫度是酵母細(xì)胞代謝活動(dòng)重要的影響因素，一般來(lái)說(shuō)，28～30℃是其最適生長(zhǎng)溫度，30～33℃是其最適發(fā)酵溫度[2]。不但酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖會(huì)受溫度的影響，而且酵母細(xì)胞細(xì)胞膜的組成成分也受溫度的影響[3]。如麥角固醇[4]、飽和及不飽和脂肪酸[5]、磷脂酰膽堿[6]等細(xì)胞膜成分會(huì)發(fā)生改變，這些成分的改變共同使酵母細(xì)胞在高溫狀態(tài)下保持膜的流動(dòng)性。ASKWITH C等[7]研究表明，銅離子環(huán)境中SOD1酶能讓酵母細(xì)胞具有高溫耐受性，在39℃條件下SOD1酶缺失菌株不能生長(zhǎng)，過(guò)量添加銅離子也不能使其回復(fù)生長(zhǎng)。這種情況說(shuō)明超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在酵母細(xì)胞高溫耐受性方面起著重要的作用。HASLBECK M等[8]研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白（heatshock protein，Hsp）與細(xì)胞的耐熱性也有聯(lián)系。研究表明，熱休克蛋白是組成型和誘導(dǎo)型的高溫響應(yīng)蛋白的統(tǒng)稱。熱休克蛋白充當(dāng)分子伴侶的角色，起促進(jìn)蛋白質(zhì)的重新折疊、修復(fù)受損蛋白、降解多余基質(zhì)的作用。

在轉(zhuǎn)錄水平上，熱休克蛋白調(diào)控酵母的應(yīng)答機(jī)制，提高細(xì)胞的高溫耐受性。SANCHEZY等[9]過(guò)量表達(dá)基因HSP104，提高了酵母細(xì)胞的高溫耐受性。另外，研究發(fā)現(xiàn)主要因?yàn)闊嵝菘说鞍仔迯?fù)蛋白時(shí)，海藻糖起到了協(xié)助作用[10-11]，才使其能夠保護(hù)細(xì)胞。越來(lái)越多的研究表明環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路中的CYR1基因、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）[12]等活性的改變也能提高細(xì)胞的高溫耐受性。cAMP信號(hào)通路在調(diào)控酵母細(xì)胞代謝、增殖、分化及壓力抗性的獲得過(guò)程中具有重要的作用[13-15]。而cAMP信號(hào)通路對(duì)酵母細(xì)胞的脅迫抗性具有很大的調(diào)節(jié)作用，MSN4基因?qū)儆赾AMP信號(hào)通路中的壓力調(diào)控因子，cAMP信號(hào)通路活性的提高就會(huì)抑制一些與壓力響應(yīng)元件相關(guān)基因的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子Msn4對(duì)壓力響應(yīng)元件相關(guān)的一些基因的表達(dá)是必須的，是cAMP信號(hào)通路抑制壓力響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的靶標(biāo)[16-18]。Msn4是鋅指蛋白，在對(duì)溫度敏感型snf1突變株多拷貝抑制物進(jìn)行分離的過(guò)程中得到MSN4基因，它可直接或間接的影響胞內(nèi)cAMP水平，進(jìn)而影響蛋白激酶A（PKA）的活性。有大量文獻(xiàn)表明，蛋白激酶A活性的高低與菌株的耐溫性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，蛋白激酶A活性高的菌株具有較低的脅迫耐受性。這些基因的過(guò)表達(dá)還可能與酵母細(xì)胞的其他耐受性有關(guān)，如細(xì)胞的耐高滲透壓、高乙醇及高乙酸等。Msn4這個(gè)反式作用元件在壓力反應(yīng)元件（stress response element，STRE）介導(dǎo)的基因表達(dá)方面發(fā)揮作用。當(dāng)MSN4過(guò)量表達(dá)時(shí)可以抑制突變snf1基因的熱敏性[19]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室菌株AY12a為出發(fā)菌株，通過(guò)胞內(nèi)同源重組法，利用基因工程操作手段將PGK1p啟動(dòng)子插入MSN4基因的N端，接著進(jìn)一步篩選驗(yàn)證得到改造后的菌株AY12a-msn4，從生長(zhǎng)性能，高溫、15%乙醇的耐受性、6%NaCl和5%乙酸等指標(biāo)考察突變株的綜合耐受性的改變，同時(shí)將突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行玉米高溫濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定發(fā)酵完成后的酒度、殘?zhí)恰?8 h細(xì)胞存活率、CO2失重和發(fā)酵時(shí)間。比較突變株及親本菌株的發(fā)酵性能，研究過(guò)表達(dá)基因?qū)︶劸平湍笣怩舶l(fā)酵性能的影響。構(gòu)建出一株高耐性菌株AY12a-msn4，不僅可以提高人們對(duì)釀酒酵母耐受性的認(rèn)識(shí)，而且可用于工業(yè)生產(chǎn)中，增加原料的利用率，可獲取更大的效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究所使用的釀酒酵母菌株及獲得的突變株見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的菌株Table 1 Strains used in this experiment

1.1.2 酶和試劑

r Taq DNA聚合酶：大連TaKaRa公司；尿嘧啶：北京泛基諾科技有限公司；α-淀粉酶（150 000 U/mL）、糖化酶（290 000 U/mL）、酸性蛋白酶（100 000 U/mL）：諾維信（中國(guó)）投資有限公司。

葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉。

合成缺陷（synthetic dropout，SD）培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，6.7 g/L無(wú)氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB），1.3 g/L尿嘧啶。

耐鹽培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，NaCl 60 g/L。

耐乙醇培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，加入15 mL/L的無(wú)水乙醇。

耐乙酸培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，5 mL/L的乙酸。

醋酸鉀（potassium acetate，KAC）生孢培養(yǎng)基：20 g/L的醋酸鉀，用蒸餾水定容至100 mL。

上述培養(yǎng)基pH自然，用蒸餾水定容至100 mL，在1.0×105Pa條件下115℃滅菌15～20 min，另外固體培養(yǎng)基額外添加20 g/L的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；UVmini-1240島津紫外分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；GL20A型高速冷凍離心機(jī)：中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司；PCT-200型聚合酶連反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀：美國(guó)BIO-RAD公司；Gel Logic212全自動(dòng)凝膠成像儀：美國(guó)SYN gENE公司；AB204-S型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BX43奧林巴斯生物顯微鏡：日本OLYMPUS會(huì)社；博歐特血球計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

表2 PCR引物設(shè)計(jì)Table 2 Design of PCR primer

1.3.2 基因過(guò)表達(dá)組件的構(gòu)建

圖1 過(guò)表達(dá)MSN4基因的構(gòu)建過(guò)程Fig.1 Construction process of overexpression of MSN4 gene

本實(shí)驗(yàn)以MSN4基因作為靶基因，野生型釀酒酵母工業(yè)菌株AY12a為親本菌株，URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，在MSN4基因的N端加入強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p，以實(shí)現(xiàn)MSN4基因的過(guò)表達(dá)。同時(shí)設(shè)計(jì)4對(duì)引物，PCR擴(kuò)增獲得帶有同源臂的4個(gè)片段，即MSN4上同源臂片段（其3'端含有URA3序列5'端同源序列）、URA3片段（其5'端含有MSN4序列3'端同源序列、其3'端含有PGK1序列5'端同源序列）、PGK1片段（其5'端含有URA3序列3'端同源序列、其3'端含有MSN4下同源臂片段5'端同源序列）、MSN4下同源臂片段（其5'端含有PGK1序列3'端同源序列）。將4個(gè)擴(kuò)增片段進(jìn)行PCR純化回收，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將純化后的片段導(dǎo)入到受體菌株AY12aΔU（URA3基因突變菌株）完成同源序列之間的同源重組，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于省卻尿嘧啶的SD培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)2～3d后得轉(zhuǎn)化子，單菌落進(jìn)行純化，精提基因組并以此為模板進(jìn)行PCR。由于受體菌株AY12aΔU含有突變的URA3基因，經(jīng)醋酸鋰化轉(zhuǎn)后同源重組正確的轉(zhuǎn)化子在SD培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)，以此篩選正確轉(zhuǎn)化子。AY12a-msn4突變株的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1。

1.3.3 釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)定OD600nm值，操作步驟如下：挑取斜面菌種1環(huán)接至5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h；吸取上述培養(yǎng)好的菌液40 μL接入裝有360 μL液體YEPD培養(yǎng)基的100孔板的孔中，將100孔板置于設(shè)定的溫度下培養(yǎng)，以YEPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔0.5 h測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的OD600nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 釀酒酵母細(xì)胞耐受性的測(cè)定

從斜面挑取一環(huán)酵母菌泥，接入5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。測(cè)OD600nm值，取適量菌液轉(zhuǎn)接入5 mL新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600nm值為0.15。將上述細(xì)胞培養(yǎng)4～6 h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，測(cè)量OD600nm值，用YEPD液體培養(yǎng)基調(diào)整所有細(xì)胞OD600nm值為1.0，以保證所有細(xì)胞初始菌體濃度一致。移液槍分別移取100 μL的菌液于1.5 mL離心管中，實(shí)驗(yàn)組用55℃水浴4 min熱擊處理，對(duì)照組不做任何處理。

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別用無(wú)菌水稀釋相同的濃度梯度，按照濃度遞減的順序，每個(gè)稀釋度分別取2 μL的菌液整齊的滴于YEPD固體培養(yǎng)基、耐鹽培養(yǎng)基、耐乙醇的培養(yǎng)基、耐乙酸培養(yǎng)基平板上，超凈臺(tái)晾干后，封口膜封好倒置于30℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體的生長(zhǎng)，比較不同菌株的耐熱、耐鹽、耐乙醇及耐乙酸情況。

1.3.5 玉米濃醪發(fā)酵

召開會(huì)議是部署、落實(shí)和推動(dòng)黨委和政府工作的慣常手段，但開會(huì)過(guò)多過(guò)濫，會(huì)導(dǎo)致行政效率下降，形式主義抬頭，工作作風(fēng)漂浮。中央的八項(xiàng)規(guī)定，其中明確要求精簡(jiǎn)會(huì)議活動(dòng)，切實(shí)改進(jìn)會(huì)風(fēng)；但“文山會(huì)?！爆F(xiàn)象在一些地方和部門屢禁不絕。這其中難免有官僚主義思想作祟，覺(jué)得開會(huì)才算重視，才是部署工作應(yīng)有的儀式。

（1）玉米水解液的制備

稱取1 500 g的玉米粉，并向其加入4 500 mL 65～70℃的自來(lái)水放置20min，讓玉米顆粒充分吸水膨脹，然后加入液化酶0.9 mL，在85～90℃水浴液化1.5 h，然后加入糖化酶3 mL于60℃水浴20 h。最后將糖化液用3層濾布過(guò)濾及可得到澄清的濾液，即為玉米水解液，煮沸滅菌后可用。

（2）種子培養(yǎng)基的制備

一級(jí)種子培養(yǎng)：調(diào)玉米水解液糖度為8°Bx，分裝各5mL，同時(shí)加入酵母粉0.5%，煮沸15～20 min，冷卻至室溫后接10%的菌液，30℃條件下靜置24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：稀釋玉米水解液糖度為12°Bx，每組取45 mL同時(shí)加入酵母粉0.5%，經(jīng)過(guò)煮沸15min后，冷卻后把一級(jí)種子液倒入二級(jí)培養(yǎng)液中，30℃條件下靜置培養(yǎng)16 h。

（3）玉米濃醪發(fā)酵

稱量60 g玉米粉于250 mL三角瓶中，加入130 mL 60～70℃的水，放置20 min糊化后加入耐高溫α-淀粉酶0.03mL，混勻后升溫至85～90℃液化1.5h，再降溫至55～60℃，加入液化酶0.09 mL及營(yíng)養(yǎng)鹽1 mL，糖化20 min后，降溫至40℃加入1.2mL的酸性蛋白酶反應(yīng)20min，然后降溫至30℃接菌5mL，每組需3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。從接菌后，每12 h稱質(zhì)量一次，直至兩次稱質(zhì)量的差＜1 g則可停止發(fā)酵，進(jìn)行蒸餾。

1.3.6 分析檢測(cè)

利用酒精比重計(jì)來(lái)對(duì)酒精產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定；采用斐林試劑法對(duì)發(fā)酵完成后的還原糖進(jìn)行測(cè)定；采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞存活率，其計(jì)算公式如下：

式中：X為釀酒酵母發(fā)酵48 h后細(xì)胞存活率，%；C1為血球計(jì)數(shù)板中經(jīng)過(guò)次甲基藍(lán)染色劑染色后著色的細(xì)胞數(shù)，個(gè)；C2為血球計(jì)數(shù)板中全部的細(xì)胞數(shù)，個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增

以親本菌株AY12a為模板，利用引物對(duì)MSN4上同源臂U和MSN4上同源臂D、MSN4-URA3U和MSN4-URA3D、MSN4-PGK1p U和MSN4-PGK1p D、MSN4下同源臂U和MSN4下同源臂D進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶有部分同源的4個(gè)基因片段，其片段長(zhǎng)度大小見(jiàn)圖2。由圖2可知，泳道1～4依次為825 bp、848 bp、1 519 bp、1 918 bp，與預(yù)期片段大小一致，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 帶有同源臂的MSN4片段擴(kuò)增驗(yàn)證電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of amplification verification of MSN4 fragment with homologous arm

2.2 突變株的獲得與驗(yàn)證

提取陰性對(duì)照AY12a基因組及驗(yàn)證正確的菌株基因組，分別利用驗(yàn)證引物進(jìn)行驗(yàn)證?？梢岳靡飳?duì)驗(yàn)證MSN4基因上的同源臂-URA3U和驗(yàn)證MSN4上的同源臂-URA3D、接著可以驗(yàn)證PGK1p-MSN4U和驗(yàn)證PGK1p-MSN4D、驗(yàn)證URA3-PGK1p U-MSN4和驗(yàn)證URA3-PGK1pD-MSN4進(jìn)行過(guò)表達(dá)MSN4基因菌株進(jìn)行定點(diǎn)驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，MSN4基因擴(kuò)增出大小為1 021 bp、2 921 bp、1 433 bp的特異性片段，與預(yù)期大小一致，且陰性對(duì)照PCR后無(wú)此條帶，說(shuō)明AY12a-msn4突變株已成功構(gòu)建。

圖3 定點(diǎn)PCR驗(yàn)證MSN4電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of verification of MSN4 by site-directed PCR

2.3 細(xì)胞融合生孢

采用標(biāo)準(zhǔn)AY12α型單倍體與改造后的突變菌株AY12amsn4進(jìn)行雜交融合，生成二倍體，將生成的二倍體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，涂布在KAC生孢培養(yǎng)基上進(jìn)行生孢，分離單倍體，對(duì)分離出來(lái)的單倍體進(jìn)行三引物驗(yàn)證和引物對(duì)驗(yàn)證MSN4上同源臂-URA3U和驗(yàn)證MSN4上同源臂-URA3D、驗(yàn)證PGK1p-MSN4和驗(yàn)證PGK1p-MSN4D、驗(yàn)證URA3-PGK1pUMSN4和驗(yàn)證URA3-PGK1pD-MSN4，以獲得α型突變株AY12α-msn4。根據(jù)以上結(jié)果，將分離出來(lái)的各個(gè)單倍體用過(guò)表達(dá)基因的驗(yàn)證引物對(duì)分離出來(lái)的單倍體進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，泳道1～3是驗(yàn)證過(guò)表達(dá)MSN4基因的片段，片段大小分別是1 021 bp、2 921 bp和1 433 bp。PCR結(jié)果均與a型突變株的PCR結(jié)果相一致，說(shuō)明成功獲得α型突變株AY12α-msn4。

圖4 菌株AY12α-msn4的PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of PCR verification of strain AY12α-msn4

2.4 釀酒酵母基因突變株與親本菌株生長(zhǎng)性能的比較

對(duì)親本菌株AY12a-msn4突變菌株根據(jù)1.3.3所示方法進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。挑取一環(huán)AY12a和AY12a-msn4菌泥接種于5 mL YPED液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后，然后對(duì)親本菌株和突變株在30℃和40℃條件下進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 突變菌株和原始菌株在30℃（A）及40℃（B）條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of the mutant and the original strains under 30℃(A)and 40℃(B)conditions

由圖5可知，在30℃的培養(yǎng)條件下AY12a-msn4與親本菌株AY12a的生長(zhǎng)速度相比，生長(zhǎng)性能基本一致；當(dāng)生長(zhǎng)溫度改為40℃時(shí)，高溫對(duì)突變株AY12a-msn4的生長(zhǎng)影響較大，較親本菌株AY12a菌體濃度沒(méi)有明顯的提高，且生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，由于所測(cè)樣品菌液都稀釋了10倍，故生長(zhǎng)15 h后，理論上菌濃OD600nm值可達(dá)到1.5左右。具體的生長(zhǎng)情況需要用玉米高溫濃醪發(fā)酵驗(yàn)證。

2.5 釀酒酵母基因突變株與親本菌株耐受性的比較

按照材料與方法中1.3.4中所描述的方法測(cè)定出發(fā)菌株AY12a以及突變菌株AY12a-msn4在55℃熱擊4 min處理，在15%（V/V）的乙醇、6%的NaCl及5%（V/V）乙酸的脅迫環(huán)境下進(jìn)行耐受性分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，在沒(méi)有生長(zhǎng)壓力的YEPD平板上，出發(fā)菌株AY12a和突變株AY12a-msn4的生長(zhǎng)情況基本上是一致的，可見(jiàn)用做耐受性實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株以及突變菌株的初始菌體濃度基本上保持是一致的。在55℃熱擊4 min處理造成的環(huán)境壓力下，出發(fā)菌株AY12a和突變菌株的生長(zhǎng)都受到了很大程度的抑制。但相比出發(fā)菌株，在相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn4的菌落數(shù)較多，說(shuō)明其熱擊抗性強(qiáng)于出發(fā)菌株并且優(yōu)于出發(fā)菌株AY12a；在15%（V/V）的乙醇和6%的NaCl造成的環(huán)境壓力下，相同的稀釋倍數(shù)下，AY12a-msn4和突變株的菌落數(shù)均低于原菌；在5%（V/V）乙酸造成的環(huán)境壓力下，相比出發(fā)菌株AY12a，突變菌株AY12a-msn4沒(méi)有較大的變化，說(shuō)明5%（V/V）的乙酸對(duì)這些突變株的生長(zhǎng)沒(méi)有協(xié)迫性。

圖6 突變菌株和原始菌株的耐受性Fig.6 Tolerance of the mutant and the original strains

2.6 釀酒酵母基因突變株與親本菌株的玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

表3 突變菌株的發(fā)酵性能和細(xì)胞存活率Table 3 Fermentation performance and cell survival rate of the mutant strain

將改造后的菌株AY12a-msn4和出發(fā)菌株AY12a進(jìn)行玉米高溫濃醪發(fā)酵。待發(fā)酵進(jìn)行48 h后，將發(fā)酵液搖勻，取樣液，用3層紗布濾去玉米渣，用無(wú)菌水稀釋至合適倍數(shù)，進(jìn)行次甲基藍(lán)染色后，放大倍數(shù)×400顯微鏡下檢測(cè)48 h細(xì)胞存活率。待發(fā)酵完成后，測(cè)定發(fā)酵液中乙醇含量，按照方法測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮?，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在38℃濃醪發(fā)酵中，突變株AY12a-msn4酒精度相比出發(fā)菌株AY12a提高了3.85%，表明其出酒率得到提升；殘?zhí)呛肯陆?4.5%，說(shuō)明改造菌的發(fā)酵性能較好，對(duì)原料的利用率高；48 h主發(fā)酵完成后的細(xì)胞存活率提高了72%。正常釀酒酵母的發(fā)酵時(shí)間為72 h[20]，而改造菌AY12a-msn4發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)了12 h，與生長(zhǎng)曲線測(cè)定的結(jié)果一致。酵母細(xì)胞發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，常伴隨著細(xì)胞耐受性的增加，比如高乙醇、高溫、高滲透壓等，但AY12a-msn4突變株沒(méi)有取得預(yù)期的效果，可能是由于菌株自身的遺傳背景和特異性所導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種AY12a為出發(fā)菌株，URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，通過(guò)基因操作來(lái)實(shí)現(xiàn)MSN4基因的過(guò)表達(dá)，即提高該基因的表達(dá)活性，從而可成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)MSN4基因的突變菌株AY12a-msn4。然后對(duì)突變株AY12a-msn4進(jìn)行耐受性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變株AY12a-msn4對(duì)高溫有一定的耐受性。同時(shí)將突變株與出發(fā)菌株AY12a進(jìn)行玉米原料高溫濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定發(fā)酵完成后的各個(gè)參數(shù)。突變株AY12a-msn4的乙醇含量較出發(fā)菌株AY12a提高了3.85%，48 h細(xì)胞存活率提高，殘?zhí)呛肯陆怠Ｒ虼藰?gòu)建的菌株AY12a-msn4可以作為工程菌株，運(yùn)用于發(fā)酵行業(yè)。