超聲輔助處理乳酸菌發(fā)酵制備米糠酵素的研究

朱德艷，施俏春，王勁松，易慶平

（荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

米糠是在把稻谷加工成稻米的過程中留下谷皮和胚芽的混合型物質(zhì)，是處理稻谷之后剩余下來的首要副產(chǎn)品，占稻谷總質(zhì)量的5%～8%[1]，全球每年平均產(chǎn)量為2 930萬t[2]，具有大量且優(yōu)良的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素B族、粗纖維、礦質(zhì)等多重營養(yǎng)成分[3]。米糠除了以上所述的營養(yǎng)成分之外，還包含其他各種天然生物活性物質(zhì)：植酸、酯類、酚類、醇類、多糖等物質(zhì)。據(jù)科學(xué)研究證明，適量地食用米糠，對人體有通便、降固醇、降血脂的效用，同時還對治療結(jié)石的患者也有一定程度的輔助作用[4]，米糠是一種重要的油脂原材料、生物化學(xué)原材料、食品藥品資源。但是，米糠比較粗糙，難以咀嚼消化，不能作為食物，食用起來不合人們口味，人們難以吞咽，不容易被人們接受。

酵素是指使用酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等有益微生物發(fā)酵果蔬及可食性藥材而得到的固體或者液體食品。除了含有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多種益生菌外[5-7]，還富含大量的蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶等代謝產(chǎn)物[8-10]，以及有機(jī)酸、低聚糖、維生素等多種營養(yǎng)成分[11-14]，并具有良好的抗氧化性[15]。米糠中的淀粉和油脂可以在水解發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為糖和小分子有機(jī)酸，更容易被微生物利用[16]。利用乳酸菌發(fā)酵米糠液，一方面可以保留米糠原有的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面還能提高蛋白酶、脂肪酶等代謝產(chǎn)物，制備米糠酵素。

目前米糠酵素具有較大的研究價值，是一個比較熱門的研究方向，但多數(shù)研究是以糙米和酵母菌發(fā)酵制備酵素。晁魯平[17]以發(fā)芽糙米作為主要原材料，蜂蜜、鹽、大麥芽粉為輔料，采用乳酸菌和酵母菌為其發(fā)酵菌種，以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量為評價指標(biāo)，制備糙米酵素；張旭普等[18]以糙米為發(fā)酵原材料，蜂蜜、NaCl為輔材，以活菌數(shù)作為評價指標(biāo)，對糙米酵素培養(yǎng)基進(jìn)行了組分優(yōu)化；李志江等[19]以米糠作為主要原材料，白糖、鹽作為輔料進(jìn)行微生物發(fā)酵制作米糠酵素；陳庶來等[20]用保鮮米糠為主要原材料，添加少量蜂蜜，以活性干酵母為發(fā)酵菌種進(jìn)行微生物發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。

超聲波在生物化學(xué)中最早應(yīng)用在粉碎細(xì)胞壁上，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)超聲波具有熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和生物效應(yīng)[21]。超聲波在微生物的發(fā)酵過程中，可使細(xì)胞短時局部破裂，從而改變細(xì)胞膜的通透性，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物快速通過細(xì)胞膜，以此達(dá)到縮短發(fā)酵時間和提高有益此生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[22]。

本研究以米糠為主要原料，采用超聲波輔助處理乳酸菌發(fā)酵制備米糠酵素，以蛋白酶及脂肪酶酶活力為評價指標(biāo)，探索米糠酵素的最佳制備工藝條件，以期為米糠酵素的加工工藝提供依據(jù)，對米糠資源的綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠：湖北金龍泉生物科技有限公司；乳酸菌（保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）∶嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）=1∶1）：北京川秀科技有限公司；斜面活化培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)：北京普新通用儀器有限公司；KQ-100KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；JY-1002型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；B-220型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DH-600（303-4）電熱恒溫培養(yǎng)箱：武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠酵素制備的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

①米糠發(fā)酵液的制備

將米糠通過擠壓膨化機(jī)膨化后取100 g，粉碎達(dá)200目，將米糠粉與蒸餾水按料水比1∶15（g∶mL）混勻，煮沸90 min，加入50 g紅糖，30 g蜂蜜，離心取上清液，調(diào)pH至6.0，121℃滅菌20 min，得米糠發(fā)酵液備用。

②乳酸菌種活化

取乳酸菌種先進(jìn)行斜面活化，再接種到MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，32℃條件下培養(yǎng)，菌種數(shù)量達(dá)到109CFU/mL，備用。

③超聲波處理

將活化的乳酸菌培養(yǎng)液按體積比3∶100加入米糠發(fā)酵液中，放入超聲波儀器中，20℃、0.15 W/m2超聲強(qiáng)度下，按試驗(yàn)要求的時間進(jìn)行處理。

④發(fā)酵

超聲波處理后，在試驗(yàn)要求的發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時間進(jìn)行靜置發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定蛋白酶、脂肪酶的酶活力。

1.3.2 米糠酵素制備工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

①超聲時間

在米糠發(fā)酵液中接入3%的乳酸菌培養(yǎng)液，調(diào)pH值為5.0，分別超聲處理0、30 min、60 min、90 min、120 min，然后在培養(yǎng)溫度為30℃條件下分別培養(yǎng)發(fā)酵20 d，測定蛋白酶、脂肪酶活力，考察超聲時間對發(fā)酵培養(yǎng)后制備的米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力的影響。

②發(fā)酵溫度

米糠發(fā)酵液中接入3%的乳酸菌培養(yǎng)液，調(diào)pH值為5.0，超聲處理60min，然后分別在溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵20 d。發(fā)酵培養(yǎng)之后測得米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力，考察發(fā)酵溫度對米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力的影響。

③初始pH值

在米糠發(fā)酵液中接入3%的乳酸菌培養(yǎng)液，分別調(diào)節(jié)初始pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，超聲處理60 min，然后在30 ℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵20 d。發(fā)酵培養(yǎng)之后測得米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力，考察初始pH值對米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力的影響。

④發(fā)酵時間

在米糠發(fā)酵液中接入3%的乳酸菌培養(yǎng)液，調(diào)pH值為5.0，超聲處理60 min，在培養(yǎng)溫度為30℃條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵15 d、20 d、25 d、30 d、35 d。發(fā)酵培養(yǎng)之后測得米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力，考察發(fā)酵時間對米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力的影響。

1.3.3 米糠酵素制備工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

為得到超聲波輔助乳酸菌發(fā)酵制備米糠酵素的最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲時間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素，以乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶酶活力為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology conditions optimization

1.3.4 測定方法

取制備好的米糠酵素離心得粗酶上清液，將濃度稀釋到3%備用。蛋白酶、脂肪酶酶活的測定方法見參考文獻(xiàn)[23]。蛋白酶酶活的定義：在40℃、1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪蛋白定義為一個酶活力單位（U）。脂肪酶酶活定義：在30℃、1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol油酸所需的脂肪酶量為一個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響

超聲時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響結(jié)果見圖1。

圖1 超聲時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on protease and lipase production of rice bran fermented by lactic acid bacteria

由圖1可知，當(dāng)未進(jìn)行超聲處理時，米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力較超聲處理之后的乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶酶活力低，分別為24.98 U/mL，脂肪酶酶活力為4.02 U/mL；當(dāng)超聲處理時間為30min時，乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)生的蛋白酶酶活力（38.06 U/mL）和脂肪酶酶活力（5.31 U/mL）力偏低；當(dāng)超聲處理時間為60min時，乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)生的蛋白酶酶活力上升至40.46U/mL，脂肪酶酶活力上升至8.79U/mL；當(dāng)超聲處理時間為90min時，蛋白酶活力為42.26 U/mL，脂肪酶酶活力為9.57U/mL；當(dāng)超聲處理時間超過90min后，乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)生的蛋白酶活力增幅不大，脂肪酶酶活力有所下降。分析其原因?yàn)槎虝r間的超聲波處理還沒有起到促進(jìn)菌種細(xì)胞生長，使乳酸菌發(fā)酵促進(jìn)米糠酵素產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的作用，適當(dāng)?shù)某曁幚碛幸嬗谌樗峋N的生長繁殖，對米糠酵素發(fā)酵過程更有益處，但隨著超聲處理時間延長，作用不明顯。因此，最適超聲處理時間為90 min。

2.2 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響

發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on protease and lipase production of rice bran fermented by lactic acid bacteria

由圖2可知，發(fā)酵溫度為15℃時，米糠酵素的蛋白酶酶活力為15.73 U/mL，脂肪酶酶活力為4.12 U/mL；隨著發(fā)酵溫度在15～25℃逐步上升，米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時，米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力均最大，分別為42.17 U/mL、9.67 U/mL；當(dāng)發(fā)酵溫度高于25℃后，米糠酵素蛋白酶、脂肪酶活力都下降。分析其原因?yàn)樵谶m宜的溫度范圍內(nèi)有利于乳酸菌對米糠的發(fā)酵改良過程，對于乳酸菌的代謝活動起到一定的促進(jìn)作用，菌體內(nèi)的酶促反應(yīng)較為活躍，有利于產(chǎn)物的積累。而當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度過低或者過高都不利于乳酸菌的生理代謝活動，影響其酶促反應(yīng)的進(jìn)行，不利于產(chǎn)物積累。因此，發(fā)酵培養(yǎng)最適溫度為25℃。

2.3 發(fā)酵初始pH值對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響

發(fā)酵初始pH值對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵初始pH值對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響Fig.3 Effect of initial p H value on protease and lipase production of rice bran fermented by lactic acid bacteria

由圖3可知，米糠發(fā)酵混合液的初始pH值為3.0時，米糠酵素的蛋白酶酶活力為21.06U/mL，脂肪酶活力為3.37U/mL；當(dāng)初始pH值逐漸增大時，米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力逐漸升高；當(dāng)初始pH值為6.0時，米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力均最大，分別為43.02 U/mL、8.23 U/mL；初始pH＞6.0后；米糠酵素的蛋白酶、脂肪酶活力降低，且蛋白酶活性比脂肪酶活性下降幅度大。分析其原因?yàn)槠嵝缘陌l(fā)酵混合液對于乳酸菌的生理代謝活動有較大影響，發(fā)酵混合液中的離子環(huán)境對于菌體細(xì)胞內(nèi)的酶的生化反應(yīng)有較大影響，而偏中性的發(fā)酵混合液對菌體發(fā)酵米糠的影響偏小，偏酸性的發(fā)酵混合液可使其發(fā)酵的過程得到更多的產(chǎn)物。因此，米糠發(fā)酵混合液的最適初始pH值為6.0。

2.4 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響

發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，在發(fā)酵15 d時，蛋白酶酶活力為20.95 U/mL，脂肪酶酶活力為3.17 U/mL；隨著發(fā)酵時間在15～30 d范圍內(nèi)的延長，蛋白酶、脂肪酶活性逐步上升；當(dāng)發(fā)酵時間為30d時，蛋白酶、脂肪酶酶活力分別為43.37U/mL、9.43 U/mL；當(dāng)發(fā)酵時間超過30 d后，蛋白酶、脂肪酶活性增幅不大。分析其原因是隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)量不斷減少，發(fā)酵能力不斷下降，代謝產(chǎn)物不再持續(xù)增加。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為30 d。

圖4 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on protease and lipase production of rice bran fermented by lactic acid bacteria

2.5 米糠酵素制備工藝條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲時間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素，以乳酸菌發(fā)酵米糠產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶酶活力為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果分別見表3、表4。

表2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology conditions optimization

由表2可知，以蛋白酶、脂肪酶酶活為評價指標(biāo)，超聲波輔助乳酸菌發(fā)酵制備的米糠酵素的最佳工藝條件組合是A2B2C2D1，即超聲時間為90min、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵混合液初始pH值為6.0、發(fā)酵時間為25 d。在此最佳工藝條件下，蛋白酶活力為51.96 U/mL，脂肪酶活力為16.17 U/mL。

表3 以蛋白酶活力為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using protease activity as evaluation index

由表3可知，4個因素P值都＜0.001，表明因素A、B、C和D都對米糠酵素中蛋白酶的活力都有極顯著的影響，4個因素對影響主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵液初始pH＞超聲處理時間＞發(fā)酵時間，與直觀分析中極差大小順序一致。

表4 以脂肪酶活力為評價指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using lipase activity as evaluation index

由表4可知，因素B、C、D的P值都＜0.001，表明這3個因素都對米糠酵素中脂肪酶的活力有極顯著的影響，4個因素對影響主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵液初始pH＞超聲處理時間＞發(fā)酵時間，與直觀分析中極差大小順序一致。

3 結(jié)論

以米糠為原材料制備風(fēng)味獨(dú)特的米糠酵素，在單因素和正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定了乳酸菌發(fā)酵米糠制備米糠酵素產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶活力的最佳條件組合，即超聲處理時間為90 min、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵液初始pH值為6.0、發(fā)酵時間為25 d，在此最佳發(fā)酵工藝條件下，蛋白酶活力為51.96 U/mL，脂肪酶活力為16.17 U/mL。

米糠中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但大多數(shù)米糠食品難以咀嚼，粗糙不易下咽。研制米糠酵素，在市場上添加一種新的健康食品，容易獲得人們的喜愛，在當(dāng)前的中國市場上有很大的上升空間。