產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類細(xì)菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化

周金虎，葉 凱，李 良，董孝元，李 夢，方尚玲，陳茂彬*

（1.發(fā)酵工程教育部重點實驗室（湖北工業(yè)大學(xué)），湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；3.工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068；4.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司，湖北 咸寧 437000；5.武漢雅仕博科技有限公司，湖北 武漢 430068）

愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是一類廣泛存在于醬香、濃香、兼香和芝麻香型白酒中的天然呈香化合物，對白酒香氣具有重要的貢獻(xiàn)[1]。研究表明，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預(yù)防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有預(yù)防疾病、抗衰老、促進(jìn)人體健康的作用[2-3]。

國內(nèi)外的相關(guān)研究表明，產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的的菌主要是一些芽孢桿菌和圓酵母。王霜等[4]從兼香型白酒酒醅中篩選到2株高產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的菌株，地衣芽孢桿菌LS9和枯草芽孢桿菌S10。王少磊等[1]從濃香型大曲中篩選到一株高產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的菌株EG06，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本試驗以從某濃香型酒廠窖泥中篩選到的高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的戴爾福特菌（Delftia sp.）為基礎(chǔ)，對細(xì)菌產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的細(xì)菌為戴爾福特菌（Delftia sp.）：本實驗室從某酒廠窖泥中篩選。

種子培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）[5]：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L，加10%NaOH溶液調(diào)整pH為7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

麩曲培養(yǎng)基[6]：麩皮100 g、水80 mL，水中加少量NaOH調(diào)整pH為7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5977B-7890B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gaschromatographymass spectrometer，GC-MS）：美國安捷倫公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

無菌條件下，挑取一環(huán)戴爾福特菌（Delftia sp.）接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計[7-9]

麩曲培養(yǎng)基水分的確定：麩皮100 g，分別按50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL添加水，NaOH調(diào)整pH值為7.2～7.4，裝入500 mL三角瓶中，接入10%種子液，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1 mL，測定愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

培養(yǎng)時間的確定：麩曲培養(yǎng)基中接入10%種子液，于37 ℃分別培養(yǎng)24 h、30 h、36 h、48 h、60 h。培養(yǎng)好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1mL，測定愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

接種量的確定：麩曲培養(yǎng)基中分別接入5%、7%、9%、11%、13%的種子液，37℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的麩曲于35℃烘干48 h后粉碎，取0.5 g麩曲，加入飽和NaCl溶液1 mL，測定愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

培養(yǎng)溫度的確定：麩曲培養(yǎng)基中接入10%種子液，分別在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的麩曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麩曲，加入飽和NaCl溶液1mL，測定愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以麩曲培養(yǎng)基水分（A）、培養(yǎng)時間（B）、接種量（C）、培養(yǎng)溫度（D）為考察因子，以愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素與水平編碼值見表1。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for bacteria culture conditions optimization

1.3.4 測定方法

愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量采用GC-MS法進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量檢測[13]。

樣品處理：取樣品0.5 g，加入飽和NaCl溶液1 mL，頂空固相微萃取20 min。氣相色譜條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進(jìn)樣口溫度260℃，載氣為氦氣（He），流速1.0mL/min，不分流進(jìn)樣。升溫程序為50℃，保持0min，再以20℃/min的速度升溫至150℃，保持0min，再以10℃/min的速率升溫至220℃，保持5 min。溶劑延遲：5 min[13]。

質(zhì)譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），采集類型：選擇離子監(jiān)測（selected ion monitor，SIM）模式掃描。電子能量70 eV，離子源溫度230℃，MS四級桿溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍50.00～600.00 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 麩曲培養(yǎng)基水分對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響

圖1 麩曲培養(yǎng)基水分對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of moisture of bran medium on guaiacols content

由圖1可知，隨著麩曲培養(yǎng)基中水分的增加，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，水分為80%時愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量最高，為3.476×10-4g/g；水分過低將降低營養(yǎng)物質(zhì)傳輸、微生物生長、酶穩(wěn)定性和基質(zhì)膨脹，水分過高將導(dǎo)致顆粒結(jié)塊、通氣不暢和染菌，從而導(dǎo)致愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量下降，因此選擇麩曲培養(yǎng)基的水分為80%。

2.1.2 培養(yǎng)時間對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響

圖2 培養(yǎng)時間對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of culture time on guaiacols content

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，培養(yǎng)時間為48 h時愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量最高，為3.521×10-4g/g。微生物的生長具有最適的生長周期，培養(yǎng)時間過短，微生物的對數(shù)生長期不能達(dá)到，菌的總體數(shù)量不多，沒有到達(dá)產(chǎn)酶的最佳時期，如果培養(yǎng)時間過長，菌種過度生長而衰老，同時在生長后期會產(chǎn)生一些有害代謝產(chǎn)物，不利于菌種的生長和代謝[10]。因此選擇培養(yǎng)時間為48 h。

2.1.3 接種量對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響

圖3 接種量對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on guaiacols content

由圖3可知，隨著接種量的增加，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)接種量為9%時愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量最高，為3.586×10-4g/g。分析原因可能是，適宜的接種量可以使菌株延滯期縮短，提前進(jìn)入對數(shù)生活期，快速產(chǎn)酶提高愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)產(chǎn)量，當(dāng)接種量＞9%時，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量下降，原因可能是由于代謝產(chǎn)物的帶入，對菌株的生長起到抑制作用[11]。因此選擇接種量為9%。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of culture temperature on guaiacols content

由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量最高，為3.589×10-4g/g。分析原因可能是培養(yǎng)溫度過低，菌種生長的相對緩慢，到達(dá)對數(shù)生長期的時間會往后延長，因此產(chǎn)酶和愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量會相對較低，而培養(yǎng)溫度過高，菌株生長較快，快速到達(dá)對數(shù)生長期，產(chǎn)酶和愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量較多，同時也會逐漸產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，對菌株的生長起到抑制作用[12]。因此選擇培養(yǎng)溫度為37℃。

2.2 Box-Behnken試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

由單因素試驗結(jié)果可知，不同試驗因素對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響有所不同。為了優(yōu)化細(xì)菌麩曲中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的最佳條件，以中心組合試驗設(shè)計原理為依據(jù)，根據(jù)單因素試驗結(jié)果分析，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計分析，共設(shè)計29次試驗，24次為析因試驗，5次中心試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表2 細(xì)菌培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for bacterium culture conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得出響應(yīng)面回歸方程如下：Y=3.65+0.16A+0.18B+0.20C+0.42D+0.18AB-0.27AC+0.68AD-9.750E-003BC+0.047BD+0.18CD-0.62A2-0.41B2-0.065C2-0.64D2。

由表3可知，根據(jù)F值各個因素對試驗結(jié)果影響次序為D＞C＞B＞A，即培養(yǎng)溫度＞接種量＞培養(yǎng)時間＞水分。建立的模型P＜0.0001，模型極顯著。失擬項P=0.5041＞0.05，表示純誤差不顯著。其中一次項B、C、D，交互項AD，二次項A2、B2、D2均呈極顯著（P＜0.01），交互項AC顯著（P＜0.05），說明相關(guān)因素對細(xì)菌麩曲中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量影響較大。決定系數(shù)R2=0.953 5，表明細(xì)菌麩曲中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量實際值與預(yù)測值擬合度。校正決定相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.907 0，表明該該模型中各因素對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量變化情況。綜上所述，此模型有效，可以來預(yù)測分析各因素對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確定水分、培養(yǎng)時間、接種量、培養(yǎng)溫度對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響，響應(yīng)曲面和等高線見圖5。

圖5 水分、培養(yǎng)時間、接種量與培養(yǎng)溫度交互作用對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between moisture,fermentation time,inoculum and fermentation temperature on guaiacol contents

由圖5可知，水分含量與培養(yǎng)時間交互作用、水分含量與接種量交互作用、水分含量與培養(yǎng)溫度交互作用、培養(yǎng)時間與接種量交互作用、培養(yǎng)時間與培養(yǎng)溫度交互作用、培養(yǎng)溫度與接種量交互作用的顯著性情況與表3中交互項P值的分析結(jié)果一致。響應(yīng)面的坡度較為陡峭，表明愈創(chuàng)木酚類的產(chǎn)量對水分與培養(yǎng)時間、水分與接種量、水分與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間與接種量、培養(yǎng)時間與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)溫度與接種量的變化較為敏感[14]。在水分不變的條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量呈先上升后下降的變化趨勢；在培養(yǎng)時間不變的條件下，隨著水分的逐漸增加，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢，且變化較大，其他交互因素同上[15]。

等高線呈圓形，表明2個因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。等高線呈橢圓形，表明2個因素之間的交互作用強度較強，影響顯著。

通過Design Expert（v8.0.6）軟件分析，產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的最佳條件為麩曲培養(yǎng)基水分81.56%、培養(yǎng)時間49.848 h、接種量11.0%、培養(yǎng)溫度38.288℃，此條件下愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的理論值為3.986×10-4g/g。

2.2.3 驗證試驗

考慮到實際操作的方便性，將本試驗所得最佳條件修改為麩曲培養(yǎng)基水分81.5%、培養(yǎng)時間50 h、接種量11.0%、培養(yǎng)溫度38℃，進(jìn)行3次平行試驗，實際測得的平均愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量為3.893×10-4g/g，試驗值與理論值相近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)菌麩曲產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類的培養(yǎng)條件是可行的。

3 結(jié)論

近年來，白酒中健康因子的研究成為越來越多科研工作者研究的熱點。研究表明，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是良好的自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預(yù)防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有預(yù)防疾病、抗衰老、促進(jìn)人體健康的作用。試驗通過單因素試驗分析了麩曲培養(yǎng)基水分含量、培養(yǎng)時間、接種量和培養(yǎng)溫度對愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響，并結(jié)合Box-Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了二次多項式模型，并經(jīng)顯著性檢驗證明了該模型具有可靠性。所得最佳培養(yǎng)條件為麩曲培養(yǎng)基水分81.5%、培養(yǎng)時間50 h、接種量11.0%、培養(yǎng)溫度38℃，在此條件下，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量為3.893×10-4g/g。通過優(yōu)化細(xì)菌麩曲制作工藝，探索各條件對麩曲制作的影響，為細(xì)菌麩曲應(yīng)用于白酒釀造行業(yè)提供一定的數(shù)據(jù)參考。