江西酸芋荷中乳酸菌的分離鑒定及在泡菜發(fā)酵中的應(yīng)用

趙山山，楊曉艷，杜秋玲，張莎莎，王 磊，邸一桓，趙國(guó)忠，郝光飛*

（1.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

腌菜制品是贛南客家常上桌的傳統(tǒng)小菜，在客家菜中地位突出。由于贛州氣候因素，客家人多以堿性米制食品為主食，而贛南客家發(fā)酵蔬菜具有開(kāi)胃、消食等特征，對(duì)人體腸胃能起到酸堿中和作用。酸芋荷是一種贛南特產(chǎn)，客家人用芋荷、辣椒、大蒜等腌制而成的一道美食佳肴，傳統(tǒng)加工工藝已有上千年的歷史，為色香味俱全的特色贛州小吃。

泡菜的生產(chǎn)是在食鹽的高滲透壓作用下以乳酸發(fā)酵為主的微生物發(fā)酵過(guò)程[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)發(fā)酵蔬菜中的乳酸菌多樣性進(jìn)行了分析，潘晴等[2]從四川老壇泡菜分離得到12株疑似乳酸菌，經(jīng)鑒定5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、3株短乳桿菌（L.brevis）、2株腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、1株干酪乳桿菌（L.casei）和1株屎腸球菌（Enterococcus faecium）。MONIKA等[3]從印度傳統(tǒng)泡菜中分離出15株乳酸菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定為7株糞腸球菌（E.faecalis）、3株植物乳桿菌（L.plantarum）、2株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、1株腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）、1株乳酸乳球菌（L.lactis）和1株腸球菌（Enterococcus sp.）。SAEEDI M 等[4]從伊朗自然發(fā)酵腌菜樣品中分離鑒定出小球菌（Pediococcus）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、魏斯氏菌（Weissella）、腸球菌（Enterococcu）和明串珠菌（Leuconostoc）。

由此可見(jiàn)，發(fā)酵蔬菜中的豐富乳酸菌資源證明了發(fā)酵蔬菜是潛在的優(yōu)質(zhì)乳酸菌的自然資源庫(kù)，其中具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌，成為制備不同種類(lèi)的乳酸菌發(fā)酵劑的良好選擇[5]。乳酸菌是泡菜生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)菌群，菌株性能與泡菜品質(zhì)有直接關(guān)系[6]。敖曉琳等[7]從四川泡菜中篩選出兩株產(chǎn)酸能力良好的乳酸菌，經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）和植物乳桿菌（L.plantarum），并通過(guò)人工接種兩種乳酸菌發(fā)酵蘿卜，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。吳偉杰等[8]分離篩選一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸糞腸球菌WJ03，接種發(fā)酵蘿卜泡菜后縮短泡菜發(fā)酵周期，改善了泡菜風(fēng)味。

本研究對(duì)江西贛州傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜酸芋荷中產(chǎn)酸乳酸菌進(jìn)行分離純化及形態(tài)觀察、生理生化、分子生物學(xué)鑒定，旨在為傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品中的菌種多樣性提供依據(jù)，為研究及改善傳統(tǒng)食品工業(yè)生產(chǎn)提供了原始數(shù)據(jù)及優(yōu)質(zhì)的菌種來(lái)源。人工接種優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵泡菜，為泡菜發(fā)酵工藝的優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸芋荷樣品：江西省贛州市寧都縣梅江鎮(zhèn)河?xùn)|村采集的農(nóng)家自制發(fā)酵食品。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、接觸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖發(fā)酵培養(yǎng)基：上海晶純?cè)噭┯邢薰尽?/p>

MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基：含1.5%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3 化學(xué)試劑

氯化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；牛膽鹽（生化試劑）：美國(guó)Solarbio公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；Microfuge 20高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；T100Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Power pac2000電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離[9]

將各種樣品分別于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵24～48 h，在無(wú)菌條件下用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)x取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的稀釋液1 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿（每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行）中，用MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基澆注，待凝固后，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。挑取有明顯溶鈣圈的單菌落平板劃線，37℃培養(yǎng)48 h，并反復(fù)多次劃線、分離、純化。將得到的單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，取1 mL培養(yǎng)液于4 500 r/min離心5 min，棄上清，菌體加入30%甘油重懸后-80℃保存，其余菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 產(chǎn)酸菌株的篩選[10]

選取1.3.1溶鈣圈較大的菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，產(chǎn)酸量測(cè)定按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的方法，用0.1 mol/L NaOH滴定，1%酚酞為指示劑。產(chǎn)酸量計(jì)算公式如下：

式中：c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；V1為樣品消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；V2為空白消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 產(chǎn)酸乳酸菌的形態(tài)觀察

觀察1.3.2中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株單菌落的菌落色澤、形態(tài)、大小，并進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)及革蘭氏染色、鏡檢。

1.3.4 乳酸菌耐酸能力測(cè)定[11]

1.3.2 中所述菌株的菌懸液5 000 r/min離心1～2 min，棄上清，用生理鹽水清洗菌體3次，pH 2.0的鹽酸重懸。酸處理2 h后分別用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)⑷∵m合稀釋度的稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，MRS培養(yǎng)基澆注平板，37℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算乳酸菌的存活率。同時(shí)未經(jīng)酸處理的菌株作為對(duì)照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每株菌每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。乳酸菌耐酸存活率計(jì)算公式如下：

式中：N1為酸耐受2 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為酸耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.5 乳酸菌耐膽鹽能力測(cè)定[12]

1.3.2 中所述菌株的菌懸液5 000 r/min離心1～2 min，棄上清，生理鹽水清洗菌體3次后，0.3%膽鹽水重懸。處理2 h后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)∵m宜稀釋度的稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，MRS培養(yǎng)基澆注平板，37℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算乳酸菌的存活率。同時(shí)未經(jīng)膽鹽處理的菌株作為對(duì)照。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每株菌每次試驗(yàn)做3個(gè)平行。乳酸菌耐膽鹽存活率計(jì)算公式如下：

式中：N1為膽鹽耐受2 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N0為膽鹽耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.6 乳酸菌耐鹽能力測(cè)定[11]

初篩：在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入10 mL的MRS培養(yǎng)基，皿底斜放，凝固后，將培養(yǎng)皿放平，再在其上倒10 mL10%NaCl的MRS培養(yǎng)基，待凝固后，室溫靜置24 h，NaCl擴(kuò)散平衡就制成耐鹽的濃度梯度平板。菌株在耐鹽濃度梯度平板上從NaCl濃度低到高的方向平行劃線，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

復(fù)篩：耐鹽初篩菌株的菌懸液以2%接種量（菌懸液濃度約為108CFU/mL）分別接種于不含NaCl及8%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，每2 h測(cè)定培養(yǎng)液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光值繪制生長(zhǎng)曲線。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每株菌每次試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.7 乳酸菌生理生化鑒定[9]

將試驗(yàn)菌株進(jìn)行明膠液化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、乳酸菌生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、6%NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.8 乳酸菌的16S rRNA基因序列分析[13]

乳酸菌基因組DNA的提?。喊凑誅NA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。

乳酸菌16S rRNA基因序列的確定。PCR體系（25 μL）：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture12.5μL，DNA模板1μL，正向引物（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、反向引物（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各1 μL，無(wú)酶水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，42℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

同源性分析：將測(cè)序得到的序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignmentsearch tool，BLAST）同源序列比對(duì)分析，從GenBank中得到參比標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列，進(jìn)行相關(guān)的同源性分析，最后運(yùn)用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.9 泡菜發(fā)酵[14]

（1）泡菜制作工藝

將新鮮芋荷、豆角洗凈，晾干，切段，入壇，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的鹽水（蔬菜∶鹽水為1∶1）浸泡，添加乳酸菌（或不添加，自然發(fā)酵）。密封常溫放置發(fā)酵。

優(yōu)良乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，5 000 r/min離心1～2 min，棄上清，生理鹽水清洗菌體，調(diào)整菌體濃度約為1×108CFU/mL，接菌量為3%。泡菜制作分為自然發(fā)酵組，人工接種A03c4組，人工接種A03d1組[15]。

（2）泡菜發(fā)酵過(guò)程中pH的測(cè)定

每24 h測(cè)定泡菜汁pH，使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)pH計(jì)后，浸入泡菜汁中，穩(wěn)定后讀數(shù)，記錄pH值。

（3）感官評(píng)價(jià)

對(duì)3組泡菜進(jìn)行感官評(píng)定。由20名專(zhuān)業(yè)人員組成評(píng)定小組，對(duì)發(fā)酵泡菜的色澤、氣味、質(zhì)地、滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)，每一項(xiàng)滿分9分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 泡菜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of pickles

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌的篩選

從江西省贛州市寧都縣梅江鎮(zhèn)河?xùn)|村采樣的發(fā)酵蔬菜酸芋荷中分離篩選得到103株產(chǎn)酸細(xì)菌，選取具有明顯溶鈣圈、菌落呈圓形凸起、濕潤(rùn)且邊緣整齊的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測(cè)定。產(chǎn)酸類(lèi)細(xì)菌在MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶鈣圈，溶鈣圈的直徑大小反映出菌株產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱。選取溶鈣圈直徑較大且產(chǎn)酸量較大的15株菌（見(jiàn)表2）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 產(chǎn)酸乳酸菌的篩選結(jié)果Table 2 Screening results for acid-producing lactic acid bacteria

2.2 篩選菌株的菌落形態(tài)

15株菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，15株菌進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果均為革蘭氏陽(yáng)性（G+）。鏡檢結(jié)果顯示，A02c2、A02d2、A02e1、A02e9、A02f3、A02f4、A03c4、A03c5、A03d1、A03d3共10株菌的菌體成桿狀，A02d5、A02e5、A02f1、A03c1、A03c3共5株菌的菌體呈短桿狀。各菌株的接觸酶（過(guò)氧化氫酶）試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。15株菌初步滿足乳酸菌的特征，為疑似乳酸菌。

表3 不同菌株形態(tài)學(xué)特征Table 3 Morphological characteristics of different strains

2.3 乳酸菌耐酸能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌經(jīng)口進(jìn)入胃腸道后，由于人體胃液中pH較低，一般介于1.5～2.0，只有少數(shù)能夠適應(yīng)胃液的強(qiáng)酸環(huán)境。因此，乳酸菌要經(jīng)過(guò)胃液進(jìn)入腸道發(fā)揮作用，必須對(duì)低pH有一定的耐受能力。不同菌株的酸耐受能力結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，分離得到的15株菌在pH 2.0的環(huán)境中處理2 h后活菌數(shù)仍可以達(dá)到108CFU/mL以上，耐酸存活率均＞96%，說(shuō)明15株菌都具有良好的耐酸能力。

表4 不同菌株的酸耐受能力Table 4 Acid resistance of different strains

2.4 乳酸菌耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

人體小腸膽鹽濃度通常為0.03%～0.30%，乳酸菌進(jìn)入腸道，會(huì)受到小腸膽鹽的抑制，因此乳酸菌進(jìn)入并且定植腸道，發(fā)揮益生作用，就必須能夠耐受0.3%膽鹽濃度。如表5所示，不同的乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受力不同，其中菌株A02e1、A03d3膽鹽處理2 h后，平板內(nèi)無(wú)菌落生長(zhǎng)，而菌株A03c4、A03d1膽鹽處理2h后，膽鹽耐受能力最好，菌株A03c4活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL，菌株A03d1活菌數(shù)達(dá)106CFU/mL。

表5 不同菌株的膽鹽耐受能力Table 5 Bile salt resistance of different strains

2.5 乳酸菌耐鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌株在NaCl濃度梯度平板上平行劃線進(jìn)行耐鹽性能的初篩，培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)15株菌均能在NaCl濃度梯度培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，但是隨著NaCl濃度的升高，菌株生存能力逐漸降低，其中菌株A02e1、A02e9、A02f3、A02f4、A03c4、A03d1、A03d3在NaCl培養(yǎng)基濃度高的一側(cè)生長(zhǎng)較好，選取這7株菌在不含有NaCl及含有8%NaCl的MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，對(duì)其耐鹽能力進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1a所示，初篩得到的7株菌株在不含NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中菌株A03d3、A03d1、A02f3、A02e1、A02f4、A02e9的延滯期較短，培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)12 h即進(jìn)入穩(wěn)定期；而菌株A03c4延滯期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)較為緩慢，培養(yǎng)14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

如圖1b所示，7株菌株在含有8%NaCl的MRS培養(yǎng)基中菌株生長(zhǎng)時(shí)均受到不同程度的抑制。菌株A03c4延滯期最長(zhǎng)，約10 h；菌株A02f3延滯期最短，培養(yǎng)3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期。菌株A03d1、A03d3、A02f4、A02e9和A02e1在含有8%NaCl的環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)延滯期依次遞增。

圖1 在無(wú)鹽（a）及8%NaCl濃度（b）條件下各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of the strains under the condition of without NaCl(a)and with 8%NaCl(b)

2.6 菌株生理生化鑒定

15株菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[9]。這15株菌初步滿足乳酸菌的特征，為疑似乳桿菌，其中菌株A02c2、A02e1、A02e9、A02f3、A02f4、A03c4、A03d1、A03d3的發(fā)酵特征與植物乳桿菌一致，可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖等大部分糖類(lèi)，但是不能發(fā)酵鼠李糖，能在15℃條件下生長(zhǎng)，45℃條件下不生長(zhǎng)，因此初步鑒定這8株菌為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。菌株A02d2、A03c5具有乳桿菌屬的特征，且與干酪乳桿菌具有相似的糖發(fā)酵特征，可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、半乳糖等，不能發(fā)酵棉子糖、阿拉伯糖，因此初步鑒定這2株菌為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。菌株A02d5、A02e5、A02f1、A03c1、A03c3除了具有乳桿菌屬的特征外，還可以發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、半乳糖、果糖、苦杏仁苷等多種糖類(lèi)，但不能發(fā)酵纖維二糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇，根據(jù)其生理生化特征將這5株菌初步鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

表6 15株菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Physiological and biochemical test results of 15 strains

續(xù)表

2.7 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

乳酸菌表型特征鑒定主要是通過(guò)乳酸菌的菌落形態(tài)特征和生理生化特征來(lái)鑒定，通常只能鑒定到屬[17]。KHALIL M I等[18]根據(jù)菌落形態(tài)和生理生化特性從鮮奶、巴氏殺菌奶、酸奶樣品中分離的13株乳酸菌中，鑒定出7株屬于乳桿菌屬，6株屬于乳酸桿菌屬。表型特征相似，并不代表基因型親源關(guān)系相近，必須利用基因型特征來(lái)進(jìn)一步鑒定[19]。在16S rRNA基因序列比對(duì)中，對(duì)屬和種的界定為：屬于同一個(gè)屬的最低同源性為95%[20]，當(dāng)同源性＞97%時(shí)，屬于同一個(gè)種[21]，如尹雪等[22]運(yùn)用16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育對(duì)從新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥中分離得到的3株乳酸菌進(jìn)行種屬鑒定，鑒定出一株同源性為100%的類(lèi)芽孢桿菌，兩株同源性為100%的芽孢桿菌。因此16S rRNA基因序列的測(cè)定與比對(duì)被廣泛用于細(xì)菌分類(lèi)地位的確定。

各乳酸菌總DNA提取后，使用通用引物分別對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增大小約為1 500 bp的產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源序列的比對(duì)分析，并使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于16S rDNA基因15株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 15 strains based on 16S rDNA genes

由圖2可知，菌株A02d2、A03c5與Lactobacillus casei ATCC334（Genbank登陸號(hào)：KC429784）的同源性高達(dá)100%，這兩株菌被鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。菌株A02e1、A02e9、A03c4、A02c2、A03d1、A02f3、A02f4、A03d3與Lactobacillus plantarum ST-III（Genbank登陸號(hào)：FJ423546）的同源性分別為99.21%、99.71%、99.86%、99.86%、99.86%、99.93%、99.86%、100%，這8株菌被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。菌株A02d5、A02f1、A02e5、A03c1、A03c3與Lactobacillus brevis ATCC 367（Genbank登陸號(hào)：NR_075024）的同源性高達(dá)100%，這5株菌被鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

2.8 乳酸菌發(fā)酵泡菜品質(zhì)的研究

2.8.1 泡菜發(fā)酵過(guò)程中pH變化

乳酸菌發(fā)酵泡菜過(guò)程中產(chǎn)生乳酸，使得發(fā)酵蔬菜具有特殊的風(fēng)味，并且不破壞蔬菜的品質(zhì)。結(jié)合菌株產(chǎn)酸、耐酸、耐膽鹽、耐鹽能力結(jié)果，選取兩株優(yōu)良菌種A03d1、A03c4人工接種發(fā)酵泡菜。

泡菜發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，3組發(fā)酵泡菜的初始pH值基本相同，均為6.40±0.03。無(wú)論是自然發(fā)酵還是人工接種乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵0～3 d的pH值下降較為明顯，3 d后pH值趨于平緩。生產(chǎn)過(guò)程中添加乳酸菌加速了泡菜的發(fā)酵，人工接種泡菜的兩組pH值明顯低于自然發(fā)酵組。人工接種乳酸菌組的pH值下降較快，相比自然發(fā)酵組，縮短了發(fā)酵泡菜達(dá)到泡菜所需pH值的發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵泡菜的生產(chǎn)率。此外，由于菌株A03d1產(chǎn)酸能力較高，因此，接種菌株A03d1組發(fā)酵泡菜過(guò)程中的pH值下降所用時(shí)間短于接種菌株A03c4組。

圖3 泡菜發(fā)酵過(guò)程中p H變化Fig.3 Changes of pH value during pickles fermentation process

為了提高泡菜生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本，縮短發(fā)酵時(shí)間是非常重要的，乳酸菌發(fā)酵泡菜可快速增加發(fā)酵體系中乳酸菌數(shù)量，降低pH值，有效縮短泡菜發(fā)酵時(shí)間；產(chǎn)酸性能可以增加發(fā)酵過(guò)程中酸性環(huán)境，抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)，提高泡菜生產(chǎn)的安全性。

2.8.2 發(fā)酵泡菜感官評(píng)價(jià)

3組發(fā)酵泡菜感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，綜合色澤、氣味、質(zhì)地、滋味評(píng)分，感官評(píng)分從高到低依次為人工接種A03d1發(fā)酵＞人工接種A03c4發(fā)酵＞自然發(fā)酵。自然發(fā)酵組色澤評(píng)分優(yōu)于其他兩組，但氣味、質(zhì)地和滋味評(píng)分較低，證明了人工接種乳酸菌發(fā)酵泡菜可以提高泡菜的品質(zhì)和風(fēng)味。人工接種A03d1、A03c4評(píng)分有所差異，說(shuō)明菌種不同發(fā)酵泡菜的品質(zhì)也有所不同。

表7 發(fā)酵泡菜感官評(píng)分結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of fermented pickles

3 結(jié)論

本研究篩選出的15株產(chǎn)酸菌經(jīng)形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA分子生物學(xué)鑒定為8株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、5株短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和2株干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）。通過(guò)耐酸、耐膽鹽、耐滲透壓能力的測(cè)定，15株產(chǎn)酸菌的酸耐受和耐鹽能力較好，在pH 2.0的酸性環(huán)境中處理2 h后活菌數(shù)并沒(méi)有明顯的下降，且均能在含有6%NaCl的環(huán)境中生長(zhǎng)。菌株A03c4、A03d1則具有較高的耐膽鹽能力，在0.3%膽鹽環(huán)境中處理2 h活菌數(shù)仍保持在106CFU/mL以上，確定為優(yōu)良菌株。人工接種乳酸菌A03c4、A03d1發(fā)酵泡菜，確定了人工接種乳酸菌在泡菜發(fā)酵中的作用，保證了泡菜品質(zhì)。

乳酸菌在發(fā)酵食品的制備中應(yīng)用愈加廣泛。優(yōu)良菌種的篩選，為食品發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)微生物資源。對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析，從中篩選出具有生產(chǎn)價(jià)值的優(yōu)良菌株，為用于制備泡菜的乳酸菌提供借鑒，為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的轉(zhuǎn)型和食品發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。