基因重組畢赤酵母產(chǎn)蛋清溶菌酶發(fā)酵工藝及表達(dá)條件的優(yōu)化

宋增健，薛 松，王向東，林 劍*

（1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；2.山東大學(xué) 應(yīng)用生命科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250000）

自從1907年Nicolle發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中含有溶解因子開(kāi)始，溶菌酶漸漸進(jìn)入人們的視野[1]。作為一種抗菌劑，它可以切斷細(xì)胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)，使菌體在滲透壓作用下裂解死亡[2]。由于溶菌酶特殊的抑菌機(jī)理，不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，從而可以緩解日益嚴(yán)重的抗生素濫用問(wèn)題[3]；作為一種天然、安全的抗菌劑，溶菌酶廣泛的應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)[4]，市場(chǎng)前景廣闊。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）食品添加劑協(xié)會(huì)在1992年公布：溶菌酶應(yīng)用在食品工業(yè)中是安全、無(wú)害的；2010年，我國(guó)衛(wèi)生部第23號(hào)公告中，批準(zhǔn)溶菌酶可以作為添加劑應(yīng)用在食品中[5]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上應(yīng)用的溶菌酶主要是從雞蛋清中分離提取，原料成本高，限制了蛋清溶菌酶的廣泛應(yīng)用[6]。因此，采用其他方法提高蛋清溶菌酶表達(dá)量非常具有研究?jī)r(jià)值。

巴斯德畢赤氏酵母（Pichia pastoris）作為一種高效、穩(wěn)定的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)易、遺傳穩(wěn)定性高、胞外蛋白表達(dá)量相對(duì)較高等優(yōu)點(diǎn)，在外源基因表達(dá)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7-10]。巴斯德畢赤氏酵母作為外源基因表達(dá)的載體，自身分泌的雜蛋白較少，分離純化成本降低[11]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于基因重組溶菌酶發(fā)酵條件的研究還處于探索階段，朱德偉[12]利用畢赤氏酵母（P.pastoris）表達(dá)基因重組溶菌酶，最高產(chǎn)量?jī)H有166.9 mg/L，與國(guó)外MASUDA T等[13]報(bào)道的最高表達(dá)量400 mg/L相差巨大。除了菌種構(gòu)建的問(wèn)題，培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)最終的表達(dá)結(jié)果也有很大的影響[14]。因此，優(yōu)化蛋清溶菌酶的表達(dá)條件，對(duì)提高目的蛋白的表達(dá)量有重要的意義。

本研究采用山東大學(xué)構(gòu)建的一株甲醇誘導(dǎo)型蛋清溶菌酶基因重組畢赤酵母NCY-2為研究對(duì)象。孫瑋遙等[15]曾在搖床水平對(duì)其進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果表明，在最佳表達(dá)條件下，搖床水平最高酶表達(dá)量為775 U/mL。雖然比優(yōu)化之前提高了2.2倍，取得了一定的研究成果，但是該發(fā)酵水平尚達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，本研究在孫瑋遙等[15]的基礎(chǔ)上，采用廉價(jià)且營(yíng)養(yǎng)豐富的麥芽汁為培養(yǎng)基[16]。在搖瓶水平上優(yōu)化菌株NCY-2生長(zhǎng)和表達(dá)條件，以期進(jìn)一步提高搖床水平發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

甲醇誘導(dǎo)型蛋清溶菌酶基因重組畢赤氏酵母（Pichia pastoris）NCY-2：山東大學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)研究中心構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 材料

麥芽：澳大利亞大麥芽。

原麥芽汁：本實(shí)驗(yàn)室制備，麥芽汁制備工藝見(jiàn)1.3.2。主要成分為還原糖（80±2）g/L、α-氨基酸態(tài)氮（500±5）mg/L。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：將原麥芽汁與水按體積比1∶1稀釋，制成種子培養(yǎng)基。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑

溶菌酶測(cè)試盒（30T/28樣）：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

100 L四器糖化設(shè)備：山東中德啤酒設(shè)備有限公司；G180TW全自動(dòng)高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPH-2102B恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

配制種子培養(yǎng)基于500 mL錐形瓶中，裝液量為20%，115℃滅菌30 min，冷卻至室溫接種，在30℃、200 r/mim的恒溫振蕩培養(yǎng)器中搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.3.2 麥芽汁糖化工藝

糖化：全麥芽糖化，不添加任何輔料，料液比1∶4（g∶mL），采用兩段浸出糖化法[17]。

1.3.3 普通錐形瓶與擋板錐形瓶對(duì)比

將原麥芽汁∶水=1∶1稀釋后，分裝于500 mL普通錐形瓶和500 mL擋板錐形瓶（內(nèi)含擋板，混合效果更好，更有利于氧氣的傳遞）中，115℃滅菌30 min冷卻至室溫接種，搖瓶培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)條件：溫度30℃，pH值5.0，轉(zhuǎn)速200 r/mim，裝液量20%。

1.3.4 原麥芽汁稀釋度的確定

將原麥芽汁與水的體積比分別按1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進(jìn)行稀釋，制成麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同1.3.3所述，在恒溫振蕩器中搖瓶培養(yǎng)24 h，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，確定原麥芽汁的最優(yōu)稀釋度。

1.3.5 外加氮源對(duì)菌株NCY-2的影響

以（NH4）2SO4和尿素為外加氮源，含量分別為：0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，原麥芽汁與水的體積比為1∶1，培養(yǎng)條件按1.3.3所述，在恒溫振蕩器中搖瓶培養(yǎng)24 h，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，確定合適的外加氮源及其含量。

1.3.6 菌株NCY-2培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合大量的文獻(xiàn)資料[18-21]確定了溫度、pH值、轉(zhuǎn)速以及接種量的優(yōu)化范圍，以菌體濃度（Y）為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)了U5（54）的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 菌株NCY-2發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案Table 1 Design of uniform experiments for strain NCY-2 fermentation technology optimization

1.3.7 甲醇添加方式對(duì)菌株NCY-2的影響

結(jié)合孫瑋遙等[15]甲醇單因素試驗(yàn)以及參考大量文獻(xiàn)[22-25]確定了甲醇的添加方式為定量添加、遞增添加、倒序添加。菌株NCY-2按照1.3.6最優(yōu)條件，于恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)24h進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)條件：溫度20℃，pH 4.0，轉(zhuǎn)速200 r/mim，甲醇添加方式及添加量按表2所示。

表2 甲醇添加方式試驗(yàn)方案Table 2 Experimental scheme of methanol addition mode

1.3.8 菌株NCY-2表達(dá)條件優(yōu)化

根據(jù)菌株NCY-2在麥芽汁培養(yǎng)基的培養(yǎng)情況，結(jié)合孫瑋遙等[15]的研究數(shù)據(jù)，按照1.3.6最優(yōu)條件進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行表達(dá)，甲醇添加方式按照1.3.7最優(yōu)結(jié)果，以發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力（E）為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)了U5（54）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案如表3所示。

表3 菌株NCY-2表達(dá)條件優(yōu)化均勻試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of uniform experiments for strain NCY-2 expression condition optimization

1.3.9 檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理方法

麥芽汁中還原糖的檢測(cè)：廉愛(ài)農(nóng)法[26]。

麥芽汁中α-氨基氮的檢測(cè)：茚三酮顯色法[27]。

發(fā)酵液中溶菌酶酶活力檢測(cè)：發(fā)酵液離心，取上清液，以溶壁微球菌為底物，37℃水浴中反應(yīng)15 min，于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度值的變化值，以蒸餾水為空白對(duì)照，以溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品（200 U/mL）為參考，溶菌酶酶活力計(jì)算公式如下：

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用DPS、Microsoft Excel分析，采用Origin 8.5.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通錐形瓶與擋板錐形瓶對(duì)比

菌株NCY-2在其生長(zhǎng)和誘導(dǎo)過(guò)程中強(qiáng)烈需氧，發(fā)酵液中的溶氧濃度是影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)的一個(gè)重要因素[28]。普通錐形瓶與擋板錐形瓶對(duì)菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 普通錐形瓶與擋板錐形瓶發(fā)酵結(jié)果對(duì)比Fig.1 Comparison of fermentation results by conical bottle and baffle cone bottle

由圖1可知，擋板錐形瓶的菌體濃度是普通錐形瓶的1.67倍，前者菌體濃度最高可達(dá)4.0×108個(gè)/mL，比普通錐形瓶更適合菌體生長(zhǎng)。因此，選用擋板錐形瓶進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 原麥芽汁稀釋度對(duì)菌株NCY-2的影響

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及其含量對(duì)菌株生長(zhǎng)至關(guān)重要。為避免稀釋度過(guò)低造成原料浪費(fèi)，增加發(fā)酵成本；稀釋度過(guò)高，菌體的生長(zhǎng)得不到滿足，本研究針對(duì)原麥芽汁的稀釋度進(jìn)行了探索。原麥芽汁稀釋度對(duì)菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 原麥芽汁稀釋度對(duì)菌株NCY-2生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of the dilution of original wort on strain NCY-2 growth

由圖2可知，原麥芽汁∶水=1∶1時(shí)，菌體長(zhǎng)勢(shì)最好，菌體濃度最高可達(dá)4.01×108個(gè)/mL，是原麥芽汁∶水=1∶2的1.60倍，隨著稀釋倍數(shù)的增大，發(fā)酵液中的菌體濃度對(duì)數(shù)值減小，所以菌體濃度降低。全麥芽培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，菌體濃度只有2.14×108個(gè)/mL，是最高值的53%。因?yàn)榇藭r(shí)發(fā)酵液中還原糖含量較高，發(fā)酵過(guò)程中次級(jí)代謝產(chǎn)物較多，抑制了菌體的生長(zhǎng)。在保證菌株NCY-2生長(zhǎng)的前提下，最大程度的節(jié)省發(fā)酵成本，因此確定原麥芽汁稀釋度為1。

2.3 外加氮源對(duì)菌株NCY-2的影響

外加氮源的種類及其含量對(duì)菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 外加氮源濃度對(duì)菌株NCY-2生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of additional nitrogen sources concentration on strain NCY-2 growth

由圖3可知，隨著（NH4）2SO4和尿素含量的增加，菌株NCY-2的菌體濃度呈明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)（NH4）2SO4的質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，菌體濃度最高為2.32×108個(gè)/mL，僅為圖2最優(yōu)結(jié)果的58%。研究結(jié)果表明，外加氮源（NH4）2SO4和尿素不能改善NCY-2的菌體生長(zhǎng)情況，過(guò)高的氮源含量反而限制了菌體的生長(zhǎng)。因此確定麥芽汁培養(yǎng)基自身氮源能夠滿足菌株NCY-2的生長(zhǎng)，不需要外加氮源。

2.4 菌株NCY-2生長(zhǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

大量的研究結(jié)果表明[29-30]，發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、以及菌種接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)有重要影響，菌株NCY-2生長(zhǎng)條件優(yōu)化結(jié)果如表4所示。

表4 菌株NCY-2發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of U 5(54)uniform experiments for fermentation technology optimization of strain NCY-2

利用DPS軟件，采用多因子及互作項(xiàng)逐步回歸方法建立了菌體濃度對(duì)數(shù)值與各因素交互作用的回歸方程：Y=4.693 11+0.021 10X1X2+0.000 10X1X3-0.000 86X1X4。多因子及互作項(xiàng)逐步回歸分析的相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如表5所示。

表5 菌體濃度對(duì)數(shù)值回歸方程的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 5 Statistical analysis of bacterial concentration on numerical regression equation

相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R2adj=0.999 5，總體顯著性檢驗(yàn)值F=1369.1369，顯著水平P=0.0199＜0.05，表示該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.0094。由回歸方程得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：溫度31.2℃、pH5.5、轉(zhuǎn)速221 r/min、接種量4%，菌體濃度預(yù)測(cè)值Y=8.88。為便于實(shí)際操作，修正最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為溫度31℃、pH5.5、轉(zhuǎn)速220 r/min、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，搖瓶培養(yǎng)后發(fā)酵液中的實(shí)際菌體濃度可達(dá)4.79×108個(gè)/mL（即Y=8.68），高于試驗(yàn)組中的任何一組樣本值，并且與預(yù)測(cè)值基本吻合。進(jìn)一步驗(yàn)證了試驗(yàn)的合理性。

2.5 甲醇添加方式對(duì)菌株NCY-2的影響

由圖4可知，不同的甲醇添加方式對(duì)菌株NCY-2的影響較大。甲醇定量添加方式中，蛋清溶菌酶酶活力隨著甲醇濃度的升高先增加后減少，定量添加3（即甲醇添加量1.5%）時(shí)，酶活力最高為488.1U/mL，是定量添加4（即甲醇添加量2%）的1.33倍。遞增添加時(shí)蛋清溶菌酶酶活力為646.6U/mL，是定量添加3（即甲醇添加量1.5%）的1.32倍。倒序添加僅為定量添加3（即甲醇添加量1.5%）的76%。研究結(jié)果顯示，遞增添加對(duì)菌株NCY-2影響最大，倒序添加抑制了菌株NCY-2的表達(dá)，蛋清溶菌酶酶活力最低。

圖4 甲醇添加方式對(duì)菌株NCY-2的影響Fig.4 Effect of methanol addition modes on strain NCY-2

2.6 菌株NCY-2表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

菌株NCY-2表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 表達(dá)條件優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)U5（54）試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Design and results of uniform experiments for expression conditions optimization

利用DPS軟件，采用多因子及互作項(xiàng)逐步回歸方法建立了溶菌酶活力與各因素交互作用的回歸方程：E=858.62398+352.963 21B-733.581 82D-0.069 09AC。

多因子及互作項(xiàng)逐步回歸分析的相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如表7所示：

表7 溶菌酶酶活力回歸方程的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Table 7 Statistical analysis of regression equation of lysozyme activity

相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R2adj=0.999 6，總體顯著性檢驗(yàn)值F=1511.6115，顯著水平P=0.0187＜0.05，表示該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=8.1162。由回歸方程得到的最優(yōu)表達(dá)條件為：溫度18.3℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速188.1 r/min、甲醇初始添加量0.3%，蛋清溶菌酶酶活力預(yù)測(cè)值Y=981.1。為便于實(shí)際操作，修正最優(yōu)表達(dá)條件為溫度18℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速190r/min、甲醇初始添加量0.3%。在此優(yōu)化條件，搖瓶培養(yǎng)后發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力實(shí)際值為962.4 U/mL，即Y=962.4，高于任何一組樣本值，并且與預(yù)測(cè)值基本吻合。為實(shí)驗(yàn)的可靠性提供了理論依據(jù)。

菌株NCY-2利用甲醇作為唯一誘導(dǎo)劑來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。一方面，在誘導(dǎo)表達(dá)期間，甲醇可以作為碳源為菌體的生長(zhǎng)代謝提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源；另一方面，作為啟動(dòng)子在醇氧化酶的作用下，進(jìn)行目的蛋白的分泌表達(dá)[31]。大量資料顯示，利用甲醇誘導(dǎo)型重組畢赤酵母來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，發(fā)酵液中的甲醇含量＞3%時(shí)，會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用[32]。本研究中，菌株NCY-2的最佳甲醇初始添加量為0.3%，之后每隔24 h分別添加體積分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%，誘導(dǎo)72 h至酶活最高時(shí)結(jié)束，整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程甲醇含量始終低于3.0%，與上述資料研究結(jié)果相符合。

3 結(jié)論

本研究完善了前者試驗(yàn)中存在的一些不足。與BMMY/BMGY培養(yǎng)基相比，采用價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)豐富的麥芽汁作為培養(yǎng)基，不僅解決了前者營(yíng)養(yǎng)單一，高溫滅菌容易產(chǎn)生沉淀等問(wèn)題，而且極大地降低了發(fā)酵成本。麥芽汁培養(yǎng)基具有進(jìn)一步放大培養(yǎng)的研究?jī)r(jià)值。

菌株NCY-2在生長(zhǎng)階段的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度31℃、pH 5.5、轉(zhuǎn)速220r/min、接種量4%，菌體濃度為4.79×108個(gè)/mL，是優(yōu)化前的2.08倍；酶表達(dá)階段的最佳表達(dá)條件為溫度18℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速190 r/min、甲醇初始添加量0.3%（之后每隔24 h分別添加體積分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%，誘導(dǎo)72 h結(jié)束），蛋清溶菌酶酶活力為962.4 U/mL。