Mcl- 1抑制劑UMI- 77誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞GBC- SD凋亡的機(jī)制研究

張生彬，劉寶琴，董長(zhǎng)城，李冰

(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

膽囊癌是膽道系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的一種，約占膽道系統(tǒng)腫瘤的2/3，但由于其病因尚未完全明確，缺少特異性的臨床表現(xiàn)，病情也很隱匿，因此，一旦確診為膽囊癌，患者的病情多已發(fā)展到中晚期，且大部分都已發(fā)生局部浸潤(rùn)或組織轉(zhuǎn)移[1- 2]。腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的重要標(biāo)志之一為細(xì)胞凋亡過程發(fā)生紊亂，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制也是腫瘤對(duì)放化療不敏感的因素之一，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是腫瘤治療的機(jī)制之一[3- 4]。凋亡途徑分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑，B淋巴細(xì)胞瘤2(B- cell lymphoma 2, Bcl- 2)和髓樣細(xì)胞白血病- 1(myeloid cell leukemia- 1,Mcl- 1)作為抗凋亡蛋白參與內(nèi)源性凋亡途徑[5]。在細(xì)胞學(xué)上，膽囊癌的進(jìn)展過程是細(xì)胞增殖和凋亡因子表達(dá)失調(diào)的結(jié)果。在膽囊癌細(xì)胞中，抗凋亡因子Bcl- 2、Mcl- 1和B淋巴細(xì)胞瘤xL(B- cell lymphoma extra large, Bcl- xL)均呈現(xiàn)過度表達(dá)，促凋亡因子Bcl- 2相關(guān)X蛋白(Bcl- 2 assaciated X protein, Bax)和Bcl- 2激活抑制蛋白(Bcl- 2 homologous antagonist killer, Bak)均呈現(xiàn)低表達(dá)，抗凋亡因子可通過其BH3結(jié)構(gòu)域與促凋亡因子形成異二聚體而保護(hù)癌細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序，從而抑制癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)膽囊癌的發(fā)展[6- 7]。近些年來，研究者從Bcl- 2和Mcl- 1入手，合成了多種抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，其單獨(dú)或聯(lián)合化療藥物使用時(shí)均具有較好的療效[8]。2014年，Abulwerdi等[9]運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及高通量篩選鑒定出Mcl- 1的一種小分子抑制劑UMI- 77，其能和Mcl- 1選擇性地結(jié)合，從而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本研究將UMI- 77應(yīng)用于膽囊癌GBC- SD細(xì)胞，了解其誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膽囊癌細(xì)胞系GBC- SD由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供；Mcl- 1抑制劑UMI- 77購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；AnnexinV/PI雙染試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京晶美生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞株增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人多克隆抗體Mcl- 1(ab28147)、兔抗人多克隆抗體Bcl- 2(ab59348)、兔抗人多克隆抗體Bcl- xL(ab2568)、兔抗人多克隆抗體Bax(ab53154)、兔抗人多克隆抗體Bak(ab69404)、兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶9剪切(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase, cleaved- caspase 9)(ab2324)、兔抗人多克隆抗體半胱氨酸蛋白酶3剪切(cleaved- caspase 3)(ab2302)和兔抗人單克隆抗體caspase切割底物(cleaved poly ADP- ribose polymerase, cleaved- PARP)(ab32064)、山羊抗兔二抗(ab6721)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人膽囊癌GBC- SD細(xì)胞用含10%胎牛血清(fatal bovine serun, FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基在含5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃采用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中(1×106個(gè)·孔-1)，每孔100 μl，按梯度加入濃度分別為0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24及48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～6 h后小心吸去上清，每孔加入100 μl甲瓚溶解液孵育，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值，同一時(shí)間點(diǎn)的OD值取其5個(gè)復(fù)孔的平均值。細(xì)胞存活率(%)=(不同濃度組OD值/0 μmol·L-1組OD值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24孔板中(1×105個(gè)·孔-1)，待次日細(xì)胞融合達(dá)到80%以上后，分別用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸并離心，加入300 μl 1×Binding Buffer進(jìn)行細(xì)胞重懸，分別加入5 μl Annexin V- FITC和5 μl碘化丙啶(PI)標(biāo)記，充分混勻后避光孵育20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)最適作用濃度和最適作用時(shí)間下GBC- SD細(xì)胞各組Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax、Bak、cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達(dá)。收集各組細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后加入裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解后離心收集上清，二辛可寧酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，每孔加入20 μl蛋白樣品，12%的十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(以1∶1 000稀釋)后4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后，加入特異性二抗(以1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后洗膜，顯影拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度定量后取其平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UMI- 77抑制GBC- SD細(xì)胞增殖

MTT檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，不同濃度的UMI- 77分別作用于GBC- SD細(xì)胞不同時(shí)間后，其細(xì)胞存活率均顯著降低，且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。與同期不添加UMI- 77的細(xì)胞相比，10 μmol·L-1及以上濃度的UMI- 77處理細(xì)胞12、24及48 h后，其細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)，即均能顯著抑制細(xì)胞增殖。后續(xù)研究選擇UMI- 77的濃度為10 μmol·L-1，處理時(shí)間為24 h。

與0 μmol·L-1處理組相比，aP<0.05

圖1不同濃度UMI-77對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖的抑制作用

Fig1InhibitoryeffectofdifferentconcentrationsofUMI-77ontheproliferationofGBC-SDcells

2.2 UMI- 77促進(jìn)GBC- SD細(xì)胞凋亡

分別用0、5、10、15、20及30 μmol·L-1的UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果如圖2所示，隨著藥物作用濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，且呈劑量依賴性。與同期不添加UMI- 77的細(xì)胞相比，不同濃度的UMI- 77處理細(xì)胞24 h后，其凋亡率均顯著增加(P<0.05)，即不同濃度的UMI- 77均能顯著促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖3)。

2.3 UMI- 77對(duì)GBC- SD細(xì)胞Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白表達(dá)的影響

Western blotting法檢測(cè)10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞前后抗凋亡蛋白Bcl- 2、Bcl- xL和Mcl- 1，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)情況如圖4所示。與未經(jīng)處理細(xì)胞組比較，10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞24 h后，其抗凋亡蛋白Mcl- 1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，但Bcl- 2和Bcl- xL的蛋白表達(dá)量無顯著性變化。

2.4 UMI- 77對(duì)GBC- SD細(xì)胞cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白表達(dá)的影響

Western blotting法檢測(cè)10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞前后cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達(dá)情況如圖5所示。與未經(jīng)處理的細(xì)胞組比較，10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞24 h后，活性片段cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達(dá)量均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A. 0 μmol·L-1組；B. 5 μmol·L-1組；C. 10 μmol·L-1組；D. 15 μmol·L-1組；E. 20 μmol·L-1組；F. 30 μmol·L-1組

圖2不同濃度UMI-77處理GBC-SD細(xì)胞24h的凋亡率

Fig2ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

圖3不同濃度UMI-77處理GBC-SD細(xì)胞24h的凋亡率

Fig3ApoptosisrateofGBC-SDcellstreatedwithdifferentconcentrationsofUMI-77for24h

3 討 論

膽囊癌作為一種最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，約占膽道系統(tǒng)腫瘤的2/3，但由于其確切的病因尚未完全闡明，缺少特異性的臨床相關(guān)指標(biāo)，病情也較隱匿，因此，確診為膽囊癌的患者的病情多數(shù)已發(fā)展到中晚期，且大部分都已發(fā)生局部浸潤(rùn)或組織轉(zhuǎn)移[1]。而膽囊癌較易發(fā)生耐藥反應(yīng)，且對(duì)于放化療均不敏感，加上其預(yù)后極差[10]，因此，探索膽囊癌相關(guān)治療靶點(diǎn)的研究尤其重要。Mcl- 1屬于Bcl- 2家族中的抗凋亡分子，其功能強(qiáng)大，作用獨(dú)特，且半衰期較短，在多種腫瘤組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[11- 12]。且當(dāng)Mcl- 1在腫瘤組織中過表達(dá)時(shí)，可顯著降低Bcl- 2抑制劑的抗腫瘤作用[13]。研究者從Mcl- 1入手，合成了多種抗凋亡蛋白的小分子抑制劑，其單獨(dú)或聯(lián)合化療藥物使用時(shí)均具有較好的療效[8]。這些研究表明Mcl- 1可能是腫瘤治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)。

腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的重要標(biāo)志之一為細(xì)胞凋亡過程發(fā)生紊亂，也是腫瘤對(duì)放化療不敏感的因素之一，因此，使用藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生是腫瘤治療的機(jī)制之一[3- 4]。近年來，關(guān)于抗凋亡蛋白抑制劑的研究逐漸增多，其中研究得較多的是關(guān)于Bcl- 2蛋白的小分子抑制劑ABT- 737及其口服衍生物ABT- 263，其對(duì)大多數(shù)抗凋亡蛋白的活性具有抑制作用，但與Mcl- 1的結(jié)合較差，出現(xiàn)Mcl- 1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞往往對(duì)ABT- 737產(chǎn)生抗藥性，因此，研究Mcl- 1蛋白抑制劑可能對(duì)腫瘤的治療具有重要意義[14- 15]。UMI- 77是Mcl- 1的一種小分子抑制劑，其能和Mcl- 1選擇性地結(jié)合，從而拮抗Mcl- 1的抗凋亡功能，發(fā)揮促凋亡作用[9]。朱雪萍等[16]的研究表明UMI- 77誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC- 803發(fā)生凋亡的機(jī)制可能是通過激活內(nèi)源性凋亡途徑，且其凋亡的發(fā)生呈現(xiàn)出劑量依賴性。本研究采用不同濃度的UMI- 77處理膽囊癌GBC- SD細(xì)胞，結(jié)果表明UMI- 77能顯著抑制GBC- SD細(xì)胞增殖，促進(jìn)GBC- SD細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。UMI- 77處理膽囊癌GBC- SD細(xì)胞24 h后，Bcl- 2家族的抗凋亡蛋白Bcl- 2和Bcl- xL的表達(dá)并無顯著性改變，而Mcl- 1的表達(dá)顯著下調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)UMI- 77選擇性結(jié)合Mcl- 1，下調(diào)Mcl- 1在細(xì)胞中的表達(dá)，阻止了Mcl- 1/Bax及Mcl- 1/Bak的異二聚化，使Bax和Bak蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究采用10 μmol·L-1UMI- 77處理GBC- SD細(xì)胞24 h后，活性的cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的表達(dá)量較未處理的細(xì)胞均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑又稱線粒體途徑，它始于線粒體，通過釋放細(xì)胞凋亡因子募集并激活caspase 9，繼而激活下游的caspase 2、caspase 3以及caspase 6等因子啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。腫瘤細(xì)胞的凋亡被抑制時(shí)，其caspase 3、caspase 9和PARP處于非活化的狀態(tài)，當(dāng)UMI- 77處理細(xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，通過caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)caspase(如cleaved- caspase 3、cleaved- caspase 9)和PARP切割并活化，最終通過內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

1表示0 μmol·L-1組；2表示10 μmol·L-1組；與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

A. Western blotting檢測(cè)Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白；B.Mcl- 1、Bcl- 2、Bcl- xL、Bax和Bak蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖4UMI-77對(duì)GBC-SD細(xì)胞Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bak蛋白表達(dá)的影響

Fig4EffectsofUMI-77ontheexpressionofMcl-1,Bcl-2,Bcl-xL,BaxandBakproteinsinGBC-SDcells

1表示0 μmol·L-1組；2表示10 μmol·L-1組；與0 μmol·L-1組相比，aP<0.05

A. Western blotting檢測(cè)cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白；B. cleaved- caspase 9、cleaved- caspase 3和cleaved- PARP蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖5UMI-77對(duì)GBC-SD細(xì)胞cleaved-caspase9、cleaved-caspase3和cleaved-PARP蛋白表達(dá)的影響

Fig5EffectsofUMI-77ontheexpressionofcleaved-caspase9,cleaved-caspase3andcleaved-PARPproteinsinGBC-SDcells

綜上所述，本研究顯示Mcl- 1的小分子抑制劑UMI- 77可抑制膽囊癌GBC- SD細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性，同時(shí)UMI- 77可通過caspase介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)GBC- SD細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量依賴性，其凋亡誘導(dǎo)可能是通過下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，表明Mcl- 1可能成為膽囊癌研究中一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，因此，對(duì)Mcl- 1的小分子抑制劑UMI- 77發(fā)揮抗腫瘤作用的具體機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究將會(huì)為抗腫瘤治療提供新選擇。