蒲公英炮制前后總黃酮含量差異研究

巨紅葉，葛心怡，焦 瑩，趙 波，劉長樂，宋 逍

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046）

蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongoLicum Hand.- Mazz、堿地蒲公英Taraxacum boreaLisinense Kitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，藥性為苦、甘、寒，歸肝、胃經(jīng)。含有多糖類、萜類、有機(jī)酸類、總黃酮類等成分，其中總黃酮類為主要有效成分。有清熱解毒、消腫散結(jié)、利濕通淋的功效[1-4]。蒲公英現(xiàn)在臨床上主要用于治療胃潰瘍、胃炎等疾病[5-7]。

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院全國名中醫(yī)的臨床經(jīng)驗(yàn)方胃舒優(yōu)在臨床上治療胃炎、胃潰瘍等胃病效果極佳，而處方中的君藥用的是蒲公英的炮制品—蒲公英炭。藥物炒炭后可增強(qiáng)藥物止血止瀉的功效或使其產(chǎn)生止血止瀉的功效，還可緩和藥性，降低毒性[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，炭藥具有吸附毒素、改善胃腸功能、抗炎等作用。2015版中國藥典第四部通則0213炒炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為“取待炮炙品置熱鍋內(nèi)用武火炒至表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色或至規(guī)定程度時(shí)，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，瞭干”[9]?！督饏T要略方論》中記載炒炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為“燒炭存性，勿令灰過”“炒令黑勿太過”[10]，炒炭工藝雖簡單，但實(shí)際上不好控制程度。并且，臨床治療胃炎、胃潰瘍多用蒲公英原藥材。基于此，本課題以蒲公英中主要有效成分總黃酮為研究對(duì)象，采用超聲提取法[11-18]研究蒲公英炮制前后總黃酮含量差異。

1 實(shí)驗(yàn)材料

QE-300 g型高速萬能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司），BL-T650CT多用途恒溫超聲波提取機(jī)（西安比朗生物科技有限公司），DC-0506低溫恒溫槽（西安比朗生物科技有限公司），UV-2600（SHIMADZU），N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，ZKF040型真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）。蒲公英藥材購自于西安萬壽路藥材市場，經(jīng)生藥教研室王繼濤老師鑒定為蒲公英屬Taraxacum F.H.Wigg植物蒲公英，蘆丁標(biāo)品（中國食品藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)：100080-201610），無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超聲提取條件設(shè)計(jì) 考慮乙醇濃度（A），超聲時(shí)間（B），超聲溫度（C），超聲功率4種因素（D），每個(gè)因素3水平，以總黃酮含量為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝[19-24]。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 蒲公英供試溶液的制備 將適量蒲公英全草粉碎成細(xì)粉和粗粉混用（細(xì)粉極易吸潮，不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行）干燥至恒重，稱取9份8.00 g分別按1.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲提取，趁熱抽濾得濾液，旋蒸到30 mL倒在蒸發(fā)皿上，60 ℃水浴蒸干至膏體，60 ℃減壓干燥，碾成粉末備用。取適量粉末置于25 mL容量瓶中，用85%的甲醇定容并完全溶解。過0.45 μL的濾膜后精密量取2 mL藥液置于25 mL的容量瓶內(nèi)，加5%硝酸鈉溶液1.0 mL，6 min后加10%硝酸鋁1.0 mL，6 min后加4% NaOH 10 mL，加水至刻度，搖勻后室溫放置15 min，待測（標(biāo)號(hào)為蒲1～蒲9）。

2.2.2 蒲公英炭供試溶液的制備 1）蒲公英炭的制備 抓切制之后適量的蒲公英放于炒鍋內(nèi)，用武火加熱，快速翻炒至略大于一半的蒲公英表面焦褐色，再迅速轉(zhuǎn)為文火，炒至全部蒲公英表面焦褐色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出晾干（通則0213）。隨機(jī)挑選炒好后的蒲公英藥材，折斷藥材，沒有灰化，部分炭化，沒有炭化的部分還能看出蒲公英原有的形狀即可（蒲公英為全草類藥材，質(zhì)地較輕，極易灰化，所以對(duì)于火候和炒制時(shí)間的把握極為重要。本實(shí)驗(yàn)中先用武火將鍋燒熱，再將蒲公英藥材倒入鍋中，30 s后迅速轉(zhuǎn)為文火，防止蒲公英灰化）。2）蒲公英炭供試溶液的制備 將炒好的蒲公英炭粉碎成細(xì)粉和粗粉混用，干燥至恒重，稱取9份5.00 g分別按2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲提取，再按2.2.1操作進(jìn)行即可（標(biāo)號(hào)為蒲炭1～蒲炭9）。

2.3 總黃酮含量的測定

2.3.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重蘆丁對(duì)照品23.03 mg，置于50 mL容量瓶中，用85%的甲醇完全溶解并定容，蘆丁對(duì)照品濃度為，分別取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于25 mL（標(biāo)號(hào)為標(biāo)1～標(biāo)7）的容量瓶中，按2.2.1中的顯色方法顯色，即得。

2.3.2 蘆丁吸收曲線 將已制備好的7個(gè)蘆丁對(duì)照品溶液置于紫外分光光度計(jì)中，在200～800 nm（間隔1 nm）下全波長掃描，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，波長（λ）為橫坐標(biāo)作圖，得到吸收曲線，最大吸收波長為508 nm。因此選定508 nm作為本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照品和樣品檢測波長。

2.4 線性關(guān)系考察 吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，依 2.2.1項(xiàng)下方法在508 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示蘆丁濃度在0.017 2～0.062 7 mg/mL間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為C = 0.091A- 0.001，r = 0.997 8

表2 蘆丁對(duì)照品溶液濃度與吸光度（λ = 508 nm）的數(shù)據(jù)表

2.5 樣品中總黃酮的含量測定 分別將提取得到的供試品溶液（蒲1～蒲9及蒲炭1～蒲炭9），按照2.2.1項(xiàng)下的方法在508 nm處采用分光光度法進(jìn)行測定，計(jì)算總黃酮含量，數(shù)據(jù)見表3與表4。因素水平見表1，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表3與表4，結(jié)合方差分析表5與表6，由結(jié)果可知影響因素主要為乙醇濃度與超聲功率，并且大小順序?yàn)橐掖紳舛龋境暪β省Ｌ崛r(shí)間與提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響并無顯著性差異。蒲公英最優(yōu)提取工藝和蒲公英炭最優(yōu)提取工藝為A1B3C3D3（提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時(shí)間為35 min，超聲溫度為60 ℃）。數(shù)據(jù)見表7。

3 結(jié)果

最優(yōu)提取方法下蒲公英與蒲公英炭總黃酮提取率的比較 根據(jù)表8分析數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論：蒲公英在提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時(shí)間為35 min，超聲溫度為60 ℃的超聲條件下提取率最高，此超聲條件（A1B3C3D3）為蒲公英最優(yōu)超聲提取條件，提取率為3.9%；蒲公英炭在提取溶劑為65%乙醇，超聲功率為462 W，超聲時(shí)間為35 min，超聲溫度為60 ℃的超聲條件下提取率最高，此超聲條件（A1B3C3D3）為蒲公英炭最優(yōu)超聲提取條件，提取率為2.9%。

表3 蒲公英總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 蒲公英炭總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表5 蒲公英總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

4 方法學(xué)考察

4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蒲3供試品溶液和蒲炭3供試品溶液按顯色后每10 min在508 nm處用紫外分光光度計(jì)依法測定吸光度值，測定7次。計(jì)算RSD值分別為0.42%和0.60%，說明蒲3供試品溶液和蒲炭3供試品溶液在70 min內(nèi)穩(wěn)定。

表6 蒲公英炭總黃酮超聲提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

表7 蒲3及蒲炭3供試溶液濃度與吸光度（508 nm）的數(shù)據(jù)表

表8 供試品溶液（蒲3、蒲炭3）數(shù)據(jù)處理表

4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取制備的總黃酮對(duì)照品1.0 mL 5份（標(biāo)號(hào)為1～5），按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度（A），計(jì)算RSD值為1.04%。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取的蒲公英供試品液（蒲3、蒲炭3）1.0 mL 5份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度（A），計(jì)算RSD值分別為0.85%和0.70%。表明重現(xiàn)性良好。

5 討論

在最優(yōu)超聲提取條件下，蒲公英總黃酮的提取率是蒲公英炭總黃酮提取率的1.34倍，原因可能為蒲公英在炒炭過程中部分炭化導(dǎo)致總黃酮有效成分部分被破壞。

而且經(jīng)研究炒炭工藝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制，就蒲公英總黃酮這一有效成分的含量而言，用蒲公英提取比蒲公英炭提取的效果好，這為在臨床上治療胃炎、胃潰瘍使用蒲公英原藥材提供了科學(xué)依據(jù)。