亞低溫對(duì)放射性肺損傷大鼠的保護(hù)作用

王遠(yuǎn)飛，李曙芳，王新鋼，王永麗，許文黎，黃立群，岳娟，安全

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院藥物安全性評(píng)價(jià)中心，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006)

最新的癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出[1]：肺癌為我國(guó)癌癥發(fā)病率之首，乳腺癌在女性癌癥中發(fā)病率最高。隨著一系列胸部腫瘤放療的增加，射線(xiàn)導(dǎo)致的肺部損傷尤為突出[2](發(fā)生率約為15% ～20%)，但是傳統(tǒng)的放射性肺損傷防治方法都存在很大的弊端，所以新的防治手段亟待提出。亞低溫在神經(jīng)系統(tǒng)等方面的保護(hù)作用已被廣泛研究，并應(yīng)用于顱腦損傷、心胸外科、急性肺損傷等領(lǐng)域[3]，但在放射性肺損傷防治方面報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)X線(xiàn)模擬機(jī)定位，直線(xiàn)加速器照射復(fù)制大鼠放射性肺損傷模型，并給予亞低溫干預(yù)，觀察并比較亞低溫與臨床常用藥氨磷汀對(duì)放射性肺損傷的防護(hù)效果，期望能夠?qū)喌蜏胤乐畏派湫苑螕p傷提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，體重(205±15)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供【SCXK(京)2016-0006】。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(晉)2013-0002】。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Elekta Synergy型醫(yī)用電子直線(xiàn)加速器、SL-IE型放射治療模擬機(jī)由山西大醫(yī)院放療科提供；H0-3多通道溫度巡檢儀、福意聯(lián)恒溫箱、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、全自動(dòng)組織脫水機(jī)、CX21型生物顯微鏡(Olympus)、酶標(biāo)儀等由中國(guó)輻射防護(hù)研究院毒理室提供。

1.1.3 主要試劑

注射用氨磷汀注射液(開(kāi)封明仁藥業(yè)有限公司)；超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽、丙二醛測(cè)定試劑盒、Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子(TNF-α)Elisa試劑盒，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，DAB染色試劑盒(博士德生物)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

75只SD大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、單純照射組、氨磷汀陽(yáng)性組、亞低溫預(yù)防組、亞低溫治療組，每組15只。每5只一組分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 模型建立及亞低溫干預(yù)

10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，在X線(xiàn)模擬機(jī)下定位照射野(全肺)，并標(biāo)記；用12 MeV電子線(xiàn)[4]進(jìn)行20 Gy垂直單次照射，源皮距100 cm，照射深度3 cm，劑量率300 cGy/min?？瞻讓?duì)照組單純麻醉，不進(jìn)行照射；單純照射組在麻醉后進(jìn)行定位及射線(xiàn)照射；氨磷汀陽(yáng)性組在照射前0.5 h內(nèi)腹腔注射氨磷汀(150 mg/kg)[5]；亞低溫預(yù)防組在麻醉后預(yù)先用冰袋使動(dòng)物體溫降至(34±1)℃范圍內(nèi)即行射線(xiàn)照射并維持亞低溫6 h；亞低溫治療組在照射后立即將大鼠置于可調(diào)節(jié)溫箱中，使其體溫維持在(34±1)℃范圍內(nèi)并持續(xù)6 h[6]。除亞低溫實(shí)驗(yàn)組外其余各組動(dòng)物體溫一律保持在正?；A(chǔ)體溫內(nèi)，體溫用多通道肛溫儀監(jiān)測(cè)，并用恒溫箱調(diào)控。

1.2.3 標(biāo)本取材及處理

于照射后6 h、14 d和35 d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組麻醉處死5只大鼠，腹主動(dòng)脈取血并于-80℃保存，稱(chēng)取全肺組織重量，計(jì)算肺系數(shù)(肺質(zhì)量mg/體重g×100%)。取各大鼠右肺前葉迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，病理取材，石蠟包埋后行HE及Masson染色，觀察病理組織學(xué)的變化，其余肺組織分裝后于-80℃中保存。檢測(cè)血清中的SOD、MDA、GSH含量；凋亡檢測(cè)試劑盒觀察各組大鼠肺組織凋亡情況；檢測(cè)各組肺組織勻漿中細(xì)胞因子TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較方差齊時(shí)采用Bonferroni方法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Games-Howell方法檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

空白對(duì)照組大鼠正常生長(zhǎng)，無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生；單純照射組大鼠在照射7 d后皮膚毛躁，相對(duì)于空白對(duì)照組活動(dòng)遲緩，在14 d左右出現(xiàn)胸毛脫落現(xiàn)象，在照射后第35天呼吸頻率明顯加快，胸部毛發(fā)脫落嚴(yán)重；氨磷汀陽(yáng)性組及亞低溫組相對(duì)于單純照射組癥狀較輕?？瞻讓?duì)照組大鼠肺組織表明光滑，呈粉紅色，彈性良好；照射后第14天單純照射組大鼠肺部顏色發(fā)暗，外形無(wú)明顯變化，氨磷汀組及亞低溫組差異不大，見(jiàn)圖1；照射后第35天單純照射組大鼠肺部明顯腫脹增大，顏色發(fā)紫并有白色結(jié)節(jié)，氨磷汀組及亞低溫預(yù)防組也有輕微小結(jié)節(jié)，肺組織顏色加深，見(jiàn)圖2，大鼠肺系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，第35天時(shí)，單純照射組的肺系數(shù)明顯提高，氨磷汀組和亞低溫預(yù)防組都有所降低(P< 0.05)，肺組織失代償性增大，而各干預(yù)能改善其肺功能。

2.2 肺組織病理組織學(xué)及膠原沉積觀察

正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，各級(jí)支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡間隔結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)充血、水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。照射后當(dāng)天，各組肺組織病理鏡檢均未見(jiàn)異常；在照射后第14天，單純照射組肺泡結(jié)構(gòu)改變伴中度纖維化出現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組及亞低溫預(yù)防組有中度纖維化但無(wú)肺泡間隔結(jié)構(gòu)改變，亞低溫治療組肺泡腔及支氣管壁輕度纖維化；照射后第35天，單純照射組肺泡及肺泡壁內(nèi)充滿(mǎn)炎性細(xì)胞并伴嚴(yán)重的肺泡壁結(jié)構(gòu)改變及纖維化，陽(yáng)性組及亞低溫預(yù)防組纖維化程度加重，亞低溫治療組炎癥及纖維化程度也有所增加，程度較輕。如圖3、圖4。

注：從左至右依次為空白對(duì)照組、單純照射組、氨磷汀陽(yáng)性組、亞低溫預(yù)防組、亞低溫治療組。圖1 照射后第14天肺組織肉眼觀察Note. From left to right: Control group, Model group, Amifostine group, Mild hypothermia prevention group, and Mild hypothermia treatment group, respectively.Figure 1 Lung tissues at 14 d after irradiation

注：從左至右依次為空白對(duì)照組、單純照射組、氨磷汀陽(yáng)性組、亞低溫預(yù)防組、亞低溫治療組。圖2 照射后第35天肺組織肉眼觀察Note. From left to right: Control group, Model group, Amifostine group, Mild hypothermia prevention group, and Mild hypothermia treatment group, respectively.Figure 2 Lung tissues at 35 days after irradiation

注：A.空白對(duì)照組；B.單純照射組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.亞低溫預(yù)防組；E.亞低溫治療組。圖3 照射后第14天肺組織病理變化(HE染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 3 Pathological changes in the rat lung tissues at 14 d after irradiation(HE staining, ×200)

注：A.空白對(duì)照組；B.單純照射組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.亞低溫預(yù)防組；E.亞低溫治療組。圖4 照射后第35天肺組織病理變化(HE染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 4 Pathological changes in the rat lung tissues at 35 d after irradiation (HE staining, ×200)

Masson染色陽(yáng)性是指肺泡及肺泡間隔內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)染條索狀物，為增生的膠原纖維組織。如圖5、圖6觀察可見(jiàn)：照射后14 d時(shí)單純照射組的膠原沉積較多，各干預(yù)組有少量沉積；照射后35 d時(shí)單純照射組膠原含量增加，氨磷汀組及亞低溫組膠原含量略有升高，程度較輕。提示亞低溫干預(yù)溫能減輕放射性肺炎及纖維化的發(fā)生、發(fā)展程度，與氨磷汀防護(hù)效果相近。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠抗氧化能力

與正常對(duì)照組比較，各照射組SOD活性都有下降趨勢(shì)；與單純照射組比較，第14天時(shí)亞低溫治療組的SOD活性恢復(fù)明顯(P< 0.05)，第35天時(shí)氨磷汀陽(yáng)性組及亞低溫治療組SOD活性回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，恢復(fù)效果優(yōu)于亞低溫預(yù)防組；與單純照射組比較，陽(yáng)性組及亞低溫干預(yù)組第14天血清中MDA含量均明顯降低(P< 0.05)，第35天單純照射組含量依然最高；各時(shí)間結(jié)點(diǎn)照射組的GSH含量都低于空白對(duì)照組，趨勢(shì)明顯。提示亞低溫在放射性肺損傷大鼠的抗氧化能力方面有較好的作用，結(jié)果列于表1。

2.4 輻照后大鼠肺組織中細(xì)胞因子TNF-α含量變化

照射后6 h除空白對(duì)照組維持在正常水平外，其余各組TNF-α含量迅速升高，其中單純照射組升高明顯，氨磷汀陽(yáng)性組及亞低溫治療組與單純照射組相比，上升程度較低(P< 0.05)；照射后第14天，各受照組仍處于較高水平，相較于照射后6 h略有下降，但各組間差異不明顯，見(jiàn)表2，表明亞低溫治療組在輻照前期對(duì)炎癥細(xì)胞因子有很好的抑制作用。

2.5 大鼠肺組織中細(xì)胞凋亡改變

利用免疫組化對(duì)細(xì)胞凋亡部位進(jìn)行染色，陽(yáng)性部位為細(xì)胞核。照射后當(dāng)天，各組肺組織病理鏡檢均未見(jiàn)陽(yáng)性，單純照射組肺泡上皮有多量細(xì)胞核呈棕黃色陽(yáng)性，陽(yáng)性組及亞低溫治療組有較多細(xì)胞核呈棕黃色，亞低溫預(yù)防組有極少量細(xì)胞核呈棕黃色。觀察顯示單純照射組發(fā)生細(xì)胞凋亡更加明顯，各干預(yù)組有所下降，亞低溫預(yù)防組凋亡細(xì)胞最少。各組鏡下觀察如圖7。

注：A.空白對(duì)照組；B.單純照射組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.亞低溫預(yù)防組；E.亞低溫治療組。圖5 照射后第14天肺組織病理變化(Masson染色，×400)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 5 Pathological changes in the rat lung tissues at 14 d after irradiation(Masson staining, ×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.單純照射組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.亞低溫預(yù)防組；E.亞低溫治療組。圖6 照射后第35天肺組織病理變化(Masson染色，×400)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 6 Pathological changes of the rat lung tissues at 35 d after irradiation(Masson staining, ×400)

注：A.空白對(duì)照組；B.單純照射組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D.亞低溫預(yù)防組；E.亞低溫治療組。圖7 照射當(dāng)天肺組織細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×200)Note. (A) Control group. (B) Model group. (C) Amifostine group. (D) Mild hypothermia prevention group. (E) Mild hypothermia treatment group.Figure 7 Cell apoptosis in the lung tissues on the day of irradiation(TUNEL staining, ×200)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠各實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較Table 1 Comparison of the experiment parameters of rats at different time points n=15)

注：與單純照射組比較,*P< 0.05；與空白對(duì)照組比較▲P< 0.05。

Note. Compared with Model group,*P< 0.05. Compared with Blank group,▲P< 0.05.

表2 肺組織勻漿中TNF-α含量Table 2 Tumor necrosis factor α content in lung homogenates at different time points n=10)

注：與單純照射組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with Model group,*P< 0.05.

3 討論

放射性肺損傷有兩種表現(xiàn)形式：放射性肺炎和放射性肺纖維化。關(guān)于這兩種形式的出現(xiàn)時(shí)間及關(guān)聯(lián)一般認(rèn)為[7]，放射性肺纖維化是由急性放射性肺炎發(fā)展而來(lái)，是損傷的第二個(gè)階段。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，照射后第14天時(shí)單純照射組肺組織炎癥反應(yīng)明顯，亞低溫干預(yù)能減輕組織炎癥，照射后第35天時(shí)單純照射組有明顯的纖維化出現(xiàn)，氨磷汀和亞低溫干預(yù)都能減輕纖維化的程度，有防護(hù)放射性肺損傷的作用。

放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)制主要為：經(jīng)過(guò)射線(xiàn)照射后超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等自由基清除酶活性降低，會(huì)使自由基清除出現(xiàn)障礙導(dǎo)致自由基的大量蓄積，進(jìn)而引發(fā)一系列生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷肺實(shí)質(zhì)；同時(shí)肺組織受到射線(xiàn)刺激后會(huì)釋放大量的炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的滲出，其中TNF-α是體內(nèi)多種細(xì)胞因子的啟動(dòng)因子[8]，可以誘導(dǎo)IL-6等其他細(xì)胞因子的合成釋放，產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，并能夠激活血小板、中性粒細(xì)胞等，進(jìn)一步釋放氧自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物等介質(zhì)，加重肺組織損傷。亞低溫治療在心腦血管等外科手術(shù)中應(yīng)用多年，對(duì)正常組織及各項(xiàng)生理指標(biāo)幾乎沒(méi)有影響[9]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)亞低溫的干預(yù)能明顯提高輻照大鼠的SOD活力，作為體內(nèi)最重要的抗氧化酶，改善機(jī)體清除自由基的能力意義重大；還原型谷胱甘肽是一種含巰基的還原劑[10]，可以通過(guò)減少氧自由基的含量發(fā)揮治療放射性肺損傷的作用，實(shí)驗(yàn)中亞低溫治療組及氨磷汀陽(yáng)性組都能夠很好的提高輻照后大鼠的GSH含量，效果相近；丙二醛是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，能間接反應(yīng)機(jī)體氧化的程度，實(shí)驗(yàn)各干預(yù)組能明顯降低其含量，達(dá)到保護(hù)的作用，但各干預(yù)組保護(hù)效果相近，差異不明顯；作為放射性肺損傷的細(xì)胞前炎癥因子，TNF-α在輻照初期改變較大，氨磷汀及亞低溫干預(yù)能夠很大程度的減少其激活，降低損害機(jī)率；放射性肺損傷發(fā)生后，適度的細(xì)胞凋亡可以清除肺泡腔及間質(zhì)中異常增殖的炎性細(xì)胞以恢復(fù)肺組織正常結(jié)構(gòu)，但是過(guò)度的細(xì)胞凋亡，尤其是肺泡上皮細(xì)胞等框架細(xì)胞的過(guò)度凋亡會(huì)導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的破壞，產(chǎn)生纖維化[11]，單純照射組中肺組織細(xì)胞大量凋亡，平衡破壞，而各干預(yù)組能夠降低凋亡細(xì)胞數(shù)，抑制凋亡。

氨磷汀是一種細(xì)胞毒性保護(hù)劑，通過(guò)抑制射線(xiàn)產(chǎn)生的過(guò)氧化物作用而減輕肺損傷，其防護(hù)作用在臨床上已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，但是在臨床應(yīng)用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)胃腸道功能失調(diào)、低血壓、低鈣性手足搐愵等不良反應(yīng)[12]，這也就需要我們?nèi)フ业礁玫姆雷o(hù)方法。本次實(shí)驗(yàn)很好的復(fù)制了大鼠放射性肺損傷模型，并且通過(guò)干預(yù)發(fā)現(xiàn)，氨磷汀組和亞低溫治療組在抗氧化及抗炎癥等方面都有明顯的防護(hù)作用，說(shuō)明亞低溫治療在放射性肺損傷防治方面或可達(dá)到替代氨磷汀的實(shí)驗(yàn)要求，為將亞低溫應(yīng)用于臨床胸部腫瘤患者的放療防護(hù)提高了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

亞低溫治療方法在放射性肺損傷防護(hù)方面具有保護(hù)作用，但是具體的作用機(jī)制還不清楚，而且最佳的臨床應(yīng)用條件也需要進(jìn)一步摸索，這也為以后的研究提供了的思路。