杜仲提取液對脂多糖誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠療效觀察和作用途徑

單旭菲，王建發(fā)，李啟濤，賀顯晶，郝丹丹，張旭，王海，武瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺的一種炎癥反應(yīng)，主要特點是乳汁的理化性質(zhì)和細(xì)菌學(xué)變化以及乳腺組織的病理學(xué)變化，導(dǎo)致乳產(chǎn)量和質(zhì)量降低[1]。存在治療成本高、廣泛流行等問題，嚴(yán)重影響患病動物的福利和健康[2]。多年以來，臨床上對乳房炎的治療主要采用抗生素療法，初期取得了較好的效果，但隨著時間的推移，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性以及機(jī)體內(nèi)藥物殘留較多，危及機(jī)體健康。除此之外，疫苗防治效果不理想，也對乳房炎的防治提出了更高的挑戰(zhàn)。因此，具有低毒性、低殘留及安全性好等優(yōu)勢的中草藥越來越受到科研工作者的青睞，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)用中草藥代替抗生素治療奶牛乳房炎擁有良好的研究前景。

杜仲具有多種藥理作用，其發(fā)揮作用的成分主要為綠原酸、黃酮類及多糖等。肖傳明等研究發(fā)現(xiàn)由杜仲醇提物等一系列中草藥植物組成的飼料添加劑能夠有效地降低奶牛的體細(xì)胞數(shù)和乳房炎的發(fā)病率，還可以提高產(chǎn)奶量，具有無毒、無殘留、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，符合畜禽產(chǎn)品安全生產(chǎn)規(guī)范。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)在安全范圍內(nèi)加大杜仲劑量對奶牛乳房炎有明顯的治療效果。杜仲在當(dāng)前的畜牧生產(chǎn)中雖然已有應(yīng)用，但主要為粉劑，其吸收效果一般。本研究以杜仲提取液為研究對象，研究其對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠的抗炎作用，為臨床研究治療奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級BALB/c小鼠104只， 6～8周齡，體重25～30 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)實驗動物中心【SCXK(黑)2013-001】，飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)實驗動物中心【SYXK(黑)2013-001】，其中雌雄鼠比例為2∶1。

1.1.2 實驗儀器

BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱：寧波賽福實驗儀器有限公司；KD-1508 A 輪轉(zhuǎn)切片機(jī)：上海之信儀器有限公司；TEC2500病理組織漂烘處理儀：上海精密儀器儀表有限公司；CKX53生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；PT-3502G酶標(biāo)儀：奧地利TECAN公司；組織勻漿器：德凡儀器有限公司；SC-2552低速離心機(jī)：上海奧豪斯有限公司；GMP-25平板搖床：上海巴玖實業(yè)有限公司。

1.1.3 實驗藥品

LPS(脂多糖)、TNF-α ELISA試劑盒等購自Sigma公司；甲醛、甲醇、乙醇、冰乙酸、正丁醇、蘇木素、伊紅、二甲苯、中性樹膠、PBS等購自吉林省昊迪化學(xué)試劑經(jīng)銷有限責(zé)任公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒：美國eBioscince公司；杜仲提取液由本實驗室提取。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲注射液的提取

將杜仲葉中的提取物中加入注射用水，使藥液的濃度濃縮至2 g/mL。加入乙醇進(jìn)行醇沉，劑量為使藥液中乙醇濃度達(dá)到75%，避光密封放置4℃冰箱過夜，過濾，將醇沉后的藥液濃縮到1.52 g/mL，加入明膠至不在產(chǎn)生沉淀，靜置30 min，加入乙醇使乙醇藥液濃度為80%，靜置12 h，過濾離心，濃縮至1 g/mL。加入0.14%亞硫酸氫鈉(W/V)和0.05%吐溫-80(V/V)，調(diào)節(jié)pH值=5，加入0.2%藥用活性炭(W/V)，45℃吸附25 min，首先進(jìn)行0.45 μm微孔濾膜粗濾，在通過0.22 μm微孔濾膜精濾，最終得到杜仲注射液。杜仲注射液外觀性狀為棕黃色液體，提取物含量為1 g/mL，有效成分綠原酸含量大于等于8 mg/mL，無可見異物以及相關(guān)物質(zhì)，符合《中國獸藥典》(2010版二部附錄)中熱原檢查、異常毒性檢查、過敏檢查以及溶血檢查等安全性實驗的相關(guān)規(guī)定。在相同的色譜條件下，供試品色譜圖中出現(xiàn)了綠原酸色譜峰，出峰位置和保留時間與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰相同，如下圖1所示。

注：圖A為綠原酸色譜圖，圖B為杜仲提取液色譜圖。圖1 綠原酸鑒別液相色譜圖Note. (A) Chromatogram of chlorogenic acid. (B) Chromatogram of the extracted eucommia.Figure 1 Chlorogenic acid identification liquid chromatogram

1.2.2 建模與分組

將小鼠進(jìn)行正常飼喂2～3 d，適應(yīng)新的環(huán)境后，將雌雄鼠比例按照2∶1的關(guān)系進(jìn)行分別合籠飼養(yǎng)，使其自然交配受孕。實驗前2 h將上述泌乳雌鼠與雄鼠分開。通過微量注射器，將預(yù)實驗篩選出的最佳劑量組50 μL濃度為0.2 mg/mL LPS通過乳導(dǎo)管緩慢勻速的注入小鼠乳腺中。

將實驗用鼠分成6組，通過乳導(dǎo)管灌注50 μL濃度為0.2 mg/mL LPS構(gòu)建小鼠乳腺炎模型，注射LPS 12 h后在腹腔注入不同濃度梯度的杜仲提取液，分為A、B、C、D、E、F 6組，A為對照組，B為LPS刺激組，C、D、E、F為給藥組，給藥劑量分別為13，20，27，33 mg/kg，每組各12只。

圖2 肉眼觀察剖檢后乳腺變化Figure 2 Visual changes in the breast tissue at autopsy

1.2.3 樣品采集及處理

在LPS刺激后12 h，進(jìn)行杜仲提取液給藥，12 h之后處死，剖檢后，通過肉眼對空白對照組、LPS刺激組以及各實驗組乳腺組織的病理特征變化進(jìn)行仔細(xì)查看。將小鼠保定消毒。用滅菌的剪刀剪開腹部皮膚，采集第四對乳腺組織，在10% (v/v)甲醛溶液中將左側(cè)剝離下來的乳腺進(jìn)行組織固定，六個實驗組均制作病理組織切片以便進(jìn)一步觀察炎癥效果，采集到的右側(cè)乳腺組織與PBS按照1∶9的比例研磨成勻漿液，離心后取上清液，按照ELISA試劑盒使用說明書操作，檢測各組乳腺組織樣品在450 nm處的OD值，依據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算各個實驗組中TNF-α、IL-6、IL-1β的相應(yīng)濃度。每組樣品均進(jìn)行3次重復(fù)實驗，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，當(dāng)P< 0.05時表示差異有顯著性，P< 0.01時表示差異有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察剖檢后乳腺變化

剖檢后眼觀乳腺組織病理變化如圖2所示，空白對照組無病理特征變化，LPS刺激組小鼠的乳腺組織可見明顯的充血、紅腫等癥狀。與LPS刺激組對比，杜仲實驗組小鼠的乳腺組織的上述癥狀明顯減弱，并隨著注射劑量的升高，癥狀緩解先逐漸加強后減弱，E組(27 mg/kg)接近正常。

2.2 乳腺組織病理組織學(xué)變化

實驗各組乳腺組織切片經(jīng)HE染色結(jié)果如下圖所示，其中A組無病理變化且腺泡結(jié)構(gòu)完整，B組中腺泡壁有明顯水腫，腺泡中出現(xiàn)大量嗜中性粒細(xì)胞等浸潤物。與B組對比，其余四組小鼠的乳腺組織損傷程度較輕，組織中腺泡結(jié)構(gòu)相對比較完整，腺泡壁水腫現(xiàn)象有所緩解，嗜中性粒細(xì)胞等浸潤物較少，E組(27 mg/kg)乳腺組織炎癥的損傷起到更加顯著的抑制作用。

2.3 乳腺組織中主要炎性細(xì)胞因子含量變化

由圖4可見，與A組相比，B組乳腺組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平極顯著的升高(#P< 0.01)。如圖5所示，C、D、E、F對乳腺組織中主要炎性細(xì)胞因子表達(dá)含量具有明顯的抑制作用，在杜仲提取液E組(27 mg/kg)的抑制效果最佳。

注：#P< 0.01表示差異極顯著。圖4 乳腺組織TNF-α含量Note. #P< 0.01indicates that the difference is extremely significant.Figure 4 Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) content in the breast tissue

注：A為對照組，B為LPS刺激組，C、D、E、F為給藥組，劑量分別為13，20，27及33 mg/kg。與空白對照組相比，#P< 0.01。與B組相比，*P< 0.05或**P< 0.01。圖5 乳腺組織中主要細(xì)胞因子含量的變化Note:(A) Control group. (B) LPS group. (C-F) Du Zhong treatment groups at 13, 20, 27, and 33 mg/kg, respectively. Compared with the control group, #P< 0.01. Compared with B group, *P < 0.05, **P< 0.01.Figure 5 Changes of major cytokines in the breast tissue

3 討論

在以往的研究中，用奶牛作為模型動物進(jìn)行研究成本過高、且操作困難。研究還發(fā)現(xiàn)以奶山羊作為模型動物成功率較大，其乳腺炎發(fā)病率和臨床癥狀均與奶牛相近，且具有高產(chǎn)奶量、高繁殖率、生長快等優(yōu)點，但因購買奶山羊成本較高、實驗操作復(fù)雜而難以作為動物乳腺炎模型進(jìn)行大量實驗[3]。因此構(gòu)建一種成本較低、操作簡單乳腺炎動物模型替代大型的動物進(jìn)行前期的實驗，不僅可以為乳腺炎的研究提供基礎(chǔ)，還可以對乳腺炎的治療途徑起到積極的推進(jìn)作用。從1970年起，Chandler首次成功建立小鼠乳腺炎模型用于乳房炎的研究[4]。有學(xué)者研究表明，經(jīng)乳導(dǎo)管注入內(nèi)毒素，可成功誘發(fā)大鼠急性乳腺炎[5]。目前，研究奶牛乳腺炎免疫機(jī)制、發(fā)病機(jī)理最常用、高效的動物模型依然是構(gòu)建小鼠乳腺炎模型[6-7]。本研究建立的乳腺炎模型從眼觀、切片和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)方面的變化均與奶牛乳腺炎一致，用杜仲提取液治療后效果明顯，且小鼠無明顯不良反應(yīng)，提示可根據(jù)小鼠和奶牛的生物等效性換算標(biāo)準(zhǔn)推測一個適宜的用藥濃度，為奶牛乳腺炎的臨床治療研究提供參考。

杜仲中含有環(huán)烯醚萜類、杜仲膠、木脂素類、苯丙素類等多種功效成分，其中綠原酸、桃葉珊瑚苷以及黃酮類等多種化合物有抗炎、抗病毒和降血壓等作用。綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸醋化形成的具有天然結(jié)構(gòu)的化合物，有研究報道其對多種病原菌都有很好的抗菌消炎作用[8-9]。本研究結(jié)果表明杜仲提取液治療后可有效降低乳腺組織炎癥細(xì)胞因子及中性粒細(xì)胞數(shù)量，我們推測可能是由于杜仲提取液中的生物活性成分綠原酸降低了LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，阻斷了中性粒細(xì)胞向乳腺組織和乳腺腺泡腔募集和遷移過程[10-11]。實驗結(jié)果表明使用杜仲提取液治療后能夠顯著降低嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量，尤其是E組(27 mg/kg)效果更佳，表明了杜仲提取液對小鼠乳腺炎癥的緩解具有劑量依賴性，能夠通過抑制炎性信號通路的活化而降低IL-1β、IL-6和TNF-α等主要炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，起到顯著緩解乳腺組織的病理損傷程度，進(jìn)而達(dá)到抗炎的目的。而當(dāng)藥物作用濃度高于E組時，抑制作用減弱，可能是由于過多的綠原酸對機(jī)體本身產(chǎn)生毒性作用，因此導(dǎo)致抑制作用的減弱，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。