磨薄顱骨后大鼠經(jīng)顱超聲灌注成像表現(xiàn)及安全性評估

周琛云，朱曉霞,，徐子林，周裕卿，唐琳,，羅燕，閻鋒,*

(1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，成都 610041； 2. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 3. 四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲影像藥物研究室，成都 610041)

第二代微泡型超聲造影劑SonoVue是一種血池造影劑，不會向血管外組織中滲透。超聲造影技術(shù)不僅可以觀察大血管的血流灌注情況，還可以對臟器的微小血管進(jìn)行觀察，從而對組織微循環(huán)的血流灌注進(jìn)行評價，因此又被稱為超聲灌注成像技術(shù)[1]。目前SonoVue已應(yīng)用于多種器官組織的微循環(huán)研究，如肝，腎等[2-3]。在顱腦方面，已有臨床研究證實經(jīng)顱超聲灌注成像技術(shù)可以在早期顯示出腦卒中患者局部腦血流灌注量的不足，區(qū)分梗死區(qū)和非梗死區(qū)，甚至有檢測“半暗帶”的能力[4- 5]。與其他活體灌注成像技術(shù)相比，經(jīng)顱超聲灌注成像技術(shù)應(yīng)用便捷、實時，有望成為更普及的活體腦灌注定量研究的影像學(xué)方法。

目前對于腦卒中機(jī)制的研究應(yīng)用最廣泛的是大鼠腦卒中線栓法模型[6]。模型大多選用體重在250～300 g 8周齡左右的SD雄性大鼠[7-8]。但由于該日齡段的大鼠顱骨厚度達(dá)0.5 mm，骨縫嚴(yán)密，無合適的骨窗容超聲波穿透，超聲在大鼠顱腦方面的研究較少。參考Errico 等[9]在大鼠顱腦研究中應(yīng)用的技術(shù)，本實驗試將大鼠右側(cè)局部顱骨(大腦中動脈分支分布區(qū)相對應(yīng)的顱骨)磨薄后進(jìn)行腦組織的超聲灌注成像，觀察其改善聲波穿透的效果及經(jīng)顱超聲灌注成像模式，并通過時間-強(qiáng)度曲線測量各定量參數(shù)的正常值范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠(SD)共48只，體重250～300 g，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司【SCXK(川)2015-030】。飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境中【SYXK(川)2013-119】，環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度為50% ～70%， 12 h 光照陰暗交替。本實驗得到四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗動物中心動物倫理委員會許可(倫理審查批準(zhǔn)編號: 2016037 A)，所有動物實驗操作均按照四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗動物中心的操作指南執(zhí)行，并符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.1.2 儀器與試劑

使用彩色多普勒超聲診斷儀(Philips iU 22，美國)，L12-5線陣探頭，經(jīng)顱超聲灌注成像技術(shù)為超聲診斷儀自帶的脈沖反轉(zhuǎn)技術(shù)。超聲造影劑使用SonoVue?(意大利Bracco公司)，每瓶含六氟化硫氣體59 mg，白色凍干粉25 mg，其微泡直徑1～10 μm，平均約2.5 μm。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

大鼠術(shù)前空腹8 h，并分為A、B兩組，分別為6 只和42只大鼠。A組大鼠在右側(cè)局部顱骨磨薄前、后分別進(jìn)行一次經(jīng)顱超聲灌注成像，比較成像效果。檢查結(jié)束后，其中4只大鼠行大腦依文思藍(lán)(EB)染色，2只行頭部核磁共振(MRI)檢查，并均于處死后取兩側(cè)顱骨骨質(zhì)做H&E染色，測量磨頭骨后剩余顱骨厚度。B組42只大鼠將右側(cè)局部顱骨磨薄后行視交叉平面的右腦經(jīng)顱超聲灌注成像。

1.2.2 磨薄顱骨手術(shù)

使用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，并用加熱毯保溫，保持大鼠體溫穩(wěn)定在(37±0.5)℃。大鼠頭部皮膚除毛消毒，頭皮做一弧形切口，用刮刀分離皮下組織直至露出顱骨表面，用雙氧水擦拭顱骨表面至可清晰顯示矢狀縫、冠狀縫及人字縫。暴露顳嵴，分離右側(cè)顳肌。將顱鉆鉆速調(diào)至1～2檔，用2.3 mm圓鉆頭打磨右側(cè)顱骨約6 mm×6 mm范圍(矢狀縫旁開6 mm，冠狀縫前3 mm至冠狀縫后3 mm的區(qū)域)，至剛能顯示大腦表面血管時，改用1.2 mm圓頭，鉆速調(diào)至0-1檔繼續(xù)打磨，直至透過剩余顱骨能清晰觀察到該區(qū)域內(nèi)的大腦表面血管，且能明顯看到腦組織向外膨出。打磨過程中注意動作輕柔緩慢，并用0.9%生理鹽水持續(xù)沖洗創(chuàng)面以降低打磨區(qū)溫度，每只大鼠打磨時間約30 min。

1.2.3 經(jīng)顱超聲灌注成像

大鼠俯臥于固定臺上，保證頭頸部呈水平位，無左右偏斜，兩前肢自然放置于頭部兩側(cè)，兩后肢自然向后伸展。將L12-5探頭固定于腦立體定位儀的立臂上，保證每次成像時超聲探頭均垂直于大鼠大腦，行冠狀切面成像。將探頭中心移動至大鼠兩眼后眥連線處上方，立體定位儀位置數(shù)值歸零，然后旋轉(zhuǎn)相應(yīng)旋鈕使探頭向尾側(cè)移動約5.5 mm至視交叉平面。下降探頭至清晰顯示大鼠大腦后進(jìn)行超聲造影檢查。超聲儀主要條件設(shè)置如下：時間補(bǔ)償增益(TGC)均置于最大處；機(jī)械指數(shù)(MI)為0.10；焦點(FOCUS)位于深度范圍0.5～0.75 cm處；超聲造影增益(Gain for Contrast)為 75%。所有大鼠檢查時均保持以上設(shè)置不改變。SonoVue干粉每瓶加入5 mL 0.9% 生理鹽水配置成溶液。每次行超聲造影時均給予0.15 mL快速經(jīng)尾靜脈團(tuán)注，并隨后推注0.3 mL的0.9%生理鹽水。團(tuán)注造影劑同時開啟計時器并存儲動態(tài)圖像30 s。A組及B組大鼠均進(jìn)行以上相同操作，其中A組在分離右側(cè)顳肌后磨骨前，進(jìn)行一次經(jīng)顱超聲灌注成像。

1.2.4 EB染色及MRI成像

A組大鼠在第二次經(jīng)顱超聲成像結(jié)束后，隨機(jī)選擇4 只SD大鼠將2% EB 溶液按 3 mL/kg 的劑量經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，2 h后使用 0.9%生理鹽水經(jīng)心臟灌注直至右心耳流出液清亮，立即斷頭取腦，觀察大腦表面 EB 染色情況，照相，放入-20℃冰箱冰凍 20 min后以 2 mm間隔自腦前極開始切片，共切 6 片，觀察腦實質(zhì)染色情況并照相。

A組剩余2只 SD 大鼠在經(jīng)顱超聲成像后 2 h使用 3T-西門子磁共振儀(Siemens Tim Trio)進(jìn)行顱腦檢查。大鼠頭部放置于直徑為60 mm 的大鼠專用接收線圈內(nèi)，采用快速自旋回波序列在三組互相垂直的方向上進(jìn)行了圖像采集。T1/T2 序列的加權(quán)相均為一組冠狀位的圖像，其具體序列參數(shù)設(shè)置如下： T1WI：TR/TE: 250 ms/12 ms；層厚: 2 mm；激勵次數(shù): 2；Matrix: 320×320；FOV read: 60 mm；FOV phase: 60 mm。 使用Gd-DTPA(0.2 mmol/kg)經(jīng)尾靜脈團(tuán)注進(jìn)行增強(qiáng)掃描，分別在用藥前、用藥后 5 min各采集 3 次圖像。T2WI：TR/TE： 8190 ms/69 ms；層厚：1 mm；激勵次數(shù)：1；Matrix：384×384；FOV：64 mm×64 mm。

1.2.5 雙側(cè)顱骨HE染色

將A組6只大鼠處死，取磨薄的骨片與對側(cè)同樣位置的骨片約4 mm×6 mm大小行HE染色。在顯微鏡下測量各骨片的厚度，每條骨片測量三次，取平均值。

1.2.6 圖像處理及統(tǒng)計分析

檢查結(jié)束后使用DICOM格式存儲圖像并進(jìn)行脫機(jī)分析。逐幀回放動態(tài)圖像，觀察右腦的灌注模式。使用儀器自帶的QLAB 8.1分析軟件，在右腦內(nèi)勾勒出范圍約22.0～23.0 mm2的感興趣區(qū)，其形態(tài)與右側(cè)腦切面類似，外側(cè)緣貼近于大鼠的腦實質(zhì)外側(cè)緣(見圖3)，得到右腦時間-強(qiáng)度曲線。使用log-normal WIWO 模式擬合曲線，得到6個定量參數(shù)：峰值強(qiáng)度(PI)、上升時間(RT)、達(dá)峰時間(TTP)、峰值下降至一半強(qiáng)度的時間(TPH)、增強(qiáng)斜率(WIS)、曲線下面積 (AUC)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 正常SD大鼠右側(cè)局部顱骨磨薄前及磨薄后經(jīng)顱超聲灌注成像的表現(xiàn)

實驗中共有4只大鼠死亡，其中3只為麻醉意外死亡，1只在磨薄顱骨過程中死亡，均另購大鼠進(jìn)行了補(bǔ)充。

A組大鼠在磨薄顱骨前行經(jīng)顱超聲灌注成像，發(fā)現(xiàn)超聲信號在矢狀縫及雙側(cè)顳嵴深面衰減極嚴(yán)重，造影增強(qiáng)強(qiáng)度極低，僅矢狀縫與雙側(cè)顳嵴之間深面的腦實質(zhì)可見輕度的增強(qiáng)(見圖1 A)。

B組大鼠于磨薄右側(cè)局部顱骨后行經(jīng)顱超聲灌注成像，矢狀縫及左側(cè)顳嵴深面衰減仍然存在，但右腦增強(qiáng)效果明顯改善(見圖1B)。

注：A. 磨薄右側(cè)局部顱骨前，右腦增強(qiáng)超聲峰值強(qiáng)度為3.67 dB；B. 磨薄右側(cè)局部顱骨后，右腦增強(qiáng)超聲峰值強(qiáng)度增加至12.01 dB。圖1 同一只大鼠磨骨前后超聲灌注成像效果的比較(L:左側(cè)；R：右側(cè))Note. (A) The peak intensity of the right hemisphere was 3.67 dB before thinning of the right skull. (B) The peak intensity of the right hemisphere increased to 12.01 dB after thinning of the skull.Figure 1 Comparison of ultrasound perfusion imaging before and after skull grinding in the same rat (L: left. R: right)

圖2 造影劑注射后不同時間的經(jīng)顱超聲灌注成像圖像(s：秒)Figure 2 Transcranial ultrasound perfusion imaging at different times after contrast agent injection (s, seconds)

逐幀觀察造影動態(tài)圖像發(fā)現(xiàn)，在造影劑注入后1～2 s大鼠右腦區(qū)域開始增強(qiáng)，增強(qiáng)迅速，至2～4 s時達(dá)高峰，各區(qū)域增強(qiáng)強(qiáng)度較為均勻一致，隨后迅速廓清，至30 s時，造影劑的廓清已降低到峰值的一半以上(見圖2和圖3)。

使用自由曲線勾勒右腦感興趣區(qū)(ROI)，平均面積為(22.36±0.2)mm2。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常SD大鼠灌注成像模式為早期快速增強(qiáng)、快速下降，后期緩慢廓清，時間-強(qiáng)度曲線表現(xiàn)為早期陡峭的上升支，下降支開始陡峭，與上升支形成一尖峰，后期下降支緩慢的下降(見圖3)。

2.2 正常SD大鼠右側(cè)局部顱骨磨薄前及磨薄后經(jīng)顱超聲灌注成像

A組6只正常SD大鼠磨頭骨前與磨頭骨后右腦實質(zhì)灌注增強(qiáng)的時間-強(qiáng)度曲線參數(shù)(見圖4)。

圖3 正常SD大鼠右腦的增強(qiáng)超聲時間-強(qiáng)度曲線Figure 3 Time-intensity curve of enhanced ultrasound in the right hemisphere of the brain in normal rats

2.3 右側(cè)大腦ROI感興趣區(qū)經(jīng)顱超聲灌注成像參數(shù)測定

實驗提取了48只正常SD大鼠右腦磨頭骨后腦實質(zhì)灌注增強(qiáng)的時間-強(qiáng)度曲線(TIC曲線)，并使用log-normal WIWO 模式擬合曲線，得到6個參數(shù)的平均值為：RT(上升時間)：(1.23±0.48)s，PI(峰值強(qiáng)度)：(9.69±1.98 dB)，AUC(曲線下面積)：(141.42±38.04)dB/s，TPH(峰值下降至一半強(qiáng)度的時間)：(12.00±6.45)s，WIS(增強(qiáng)斜率)：(7.85±2.53)dB/s，TTP(達(dá)峰時間)：(4.16±0.89) s。

2.4 磨頭骨聯(lián)合經(jīng)顱超聲造影技術(shù)對腦組織的安全性評估

與對側(cè)未打磨的區(qū)域相比，EB 染色顯示右側(cè)打磨區(qū)域的大腦皮質(zhì)及實質(zhì)內(nèi)均無明顯藍(lán)染區(qū)域，核磁T2WI顯示打磨區(qū)域的腦組織表面沒有明顯高信號；增強(qiáng)MRI未見造影劑局部濃聚區(qū)(見圖5)。

圖4 正常SD大鼠磨頭骨前與磨頭骨后右腦時間-強(qiáng)度曲線各定量參數(shù)的比較Figure 4 Comparison of parameters of the time-intensity curve before and after skull thinning in normal rats

注：A：EB染色后的大腦表面無明顯藍(lán)染區(qū)；B：EB 染色切片顯示大腦皮質(zhì)及實質(zhì)內(nèi)均無明顯藍(lán)染區(qū)域；C: MRI T2WI 顯示腦組織內(nèi)無明顯腦水腫表現(xiàn)；D：增強(qiáng)MRI未見造影劑局部濃聚區(qū)。圖5 磨薄部分顱骨及經(jīng)顱超聲對腦組織的安全性評估Note. (A) No obvious Evans blue staining on the brain surface. (B) No obvious Evans blue staining in the cerebral cortex or parenchyma (C) No obvious cerebral edema on T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI). (D) No local concentration of contrast agent was observed by enhanced MRI.Figure 5 Assessment of the safety of skull thinning and transcranial contrast-enhanced ultrasound

2.5 磨薄后的顱骨及其HE染色

HE染色顯示剩余骨片的厚度平均值為(66.1±11.4)μm，對側(cè)相應(yīng)區(qū)域的平均值為(202.0±23.2)μm(圖6)。

注：A. 磨薄顱骨后的大鼠頭部；B. 磨薄的顱骨照片；C. 左側(cè)相同位置未經(jīng)磨薄的顱骨HE切片；D. 右側(cè)局部磨薄的顱骨HE切片。圖6 磨薄顱骨后的大鼠頭部、剩余顱骨骨片及顱骨的H&E染色切片Note. (A) Rat cranium after grinding of the skull. (B) The thinned skull. (C) Histology of the unthinned skull at the equivalent position on the left hemisphere.(HE stainning) (D) Histology of the thinned skull on the right side.Figure 6 The skull after skull-thinning surgery

3 討論

為消除骨質(zhì)對超聲的衰減，保證經(jīng)顱超聲灌注成像的效果，進(jìn)行開顱操作肯定是最佳的，但這種操作也會帶來一些不良影響，如腦水腫、顱內(nèi)壓的改變、血-腦脊液屏障的破壞等[10- 11]。因此本實驗只磨薄局部顱骨，并保證了大腦微環(huán)境的穩(wěn)定。磨骨技術(shù)的關(guān)鍵是必須保持低轉(zhuǎn)速，最大程度的降低機(jī)械力對腦組織的損傷。同時還需要使用室溫的生理鹽水不斷地沖洗創(chuàng)面，極大的控制了局部溫度的升高。Urban等[10]已經(jīng)通過免疫染色的方法證實了這樣的操作可以有效的降低局部的炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞的死亡。我們在進(jìn)行經(jīng)顱超聲灌注成像時也密切關(guān)注操作的安全性。我們將超聲造影的機(jī)械指數(shù)設(shè)定為0.10，造影劑劑量選擇有效檢測的最小劑量0.15 mL，每次超聲檢查時間控制在10 min之內(nèi)，避免了經(jīng)顱超聲檢查可能導(dǎo)致的顱內(nèi)溫度升高及腦組織損傷等問題[12-13]。

血-腦脊液屏障是大腦具有保護(hù)作用的重要特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可使腦組織不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，以保證腦內(nèi)生理狀況的穩(wěn)定性[15]。打磨顱骨和超聲波都有導(dǎo)致血-腦脊液屏障通透性增加的風(fēng)險。EB染色是目前使用最廣泛的檢測血-腦脊液屏障開放性的手段之一。依文思藍(lán)為一種相對分子質(zhì)量為961的藍(lán)色染料，一般不會穿過血管壁，經(jīng)心臟灌注后可被完全清除，但一旦穿過血管壁進(jìn)入到腦組織中則無法通過經(jīng)心臟灌注方法所清除而在腦中顯示出藍(lán)染區(qū)域，因此可用于評價血-腦脊液屏障的通透性[16]。核磁造影劑為一種釓劑(Gd-DTPA)，分子量更小，僅約500，且不與血液成分結(jié)合，能更加有效的評價更細(xì)微的血-腦脊液屏障開放[17]。通過這兩種手段，我們初步驗證了磨薄大鼠局部顱骨聯(lián)合經(jīng)顱超聲灌注成像不會破壞血-腦脊液屏障，證明這個技術(shù)具有一定的安全性。

本實驗比較了A組6只大鼠磨薄顱骨前后經(jīng)顱超聲灌注成像參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有與聲強(qiáng)相關(guān)的參數(shù)，前后有顯著差異，但時間參數(shù)均沒有明顯差異。綜上所述磨薄顱骨可以明顯改善大腦造影效果，但不會影響血流灌注速度。

峰值強(qiáng)度(PI)是反映組織腦血流灌注狀態(tài)的重要指標(biāo)，是反映在單位體積內(nèi)造影劑的劑量[2]。既往文獻(xiàn)中以人腦超聲造影的研究較多，但由于受到顱骨骨質(zhì)厚度及檢測深度等因素的影響，各參數(shù)差異較大，比如PI在正常人群中的范圍可達(dá)3～6倍，因此很難在人與人之間進(jìn)行比較[14]。而在我們的實驗中，B組48只磨骨后正常大鼠的PI表現(xiàn)出了較好的一致性，說明了該實驗方法在大鼠腦灌注成像定量研究中的可行性，同時也證明經(jīng)顱超聲灌注成像在活體大鼠大腦灌注的研究中可能具有很好的應(yīng)用價值。

本研究也存在一定的局限性。為了盡量減小對大鼠的損傷并縮短手術(shù)時長，本研究沒有對大鼠左側(cè)顱骨進(jìn)行磨骨操作，因此不能進(jìn)行兩側(cè)腦組織灌注的對比分析。另外，我們使用的超聲造影劑SonoVue是目前國內(nèi)唯一能應(yīng)用于人體的造影劑，安全性好，但穩(wěn)定性欠佳，在高頻探頭條件下成像效果有限，廓清過于快速，不利于后期對低灌注區(qū)的仔細(xì)觀察。未來如能自行研制長循環(huán)造影劑，應(yīng)該能明顯改善成像的效果。

4 小結(jié)

本實驗通過磨薄顱骨的技術(shù)將顱骨的厚度控制在一定的范圍之內(nèi)，顯著改善了SD大鼠大腦的經(jīng)顱超聲灌注成像效果，并通過EB染色及MRI成像初步證實了該操作的安全性。使用磨薄顱骨后的經(jīng)顱超聲灌注成像有望成為未來腦缺血、腦出血等大鼠模型中一種快速、實時、準(zhǔn)確的評估腦血流灌注的影像學(xué)方法。同時經(jīng)顱超聲灌注成像為血流動力學(xué)相關(guān)的腦疾病(如卒中、膠質(zhì)瘤、血管硬化等)提供了新的活體影像分析手段。