山地虎耳草轉錄組SSR信息分析

李 彥 更吉卓瑪 賈留坤 王智華 陳世龍 高慶波

(1.中國科學院高山植物適應與進化重點實驗室，中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001； 2.中國科學院大學，北京 100039； 3.青海省作物分子育種重點實驗室，中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001)

青藏高原復雜的地理拓撲結構、特殊的自然環(huán)境以及豐富獨特的生物資源，使其成為全球25個生物多樣性重點保護地區(qū)之一[1]。研究表明，第四紀冰期與間冰期反復交替所引起的氣候波動嚴重影響了該地區(qū)現(xiàn)有生物類群的地理分布和遺傳結構[2～3]。山地虎耳草(SaxifragasinomontanaJ.T.Pan & Gornall)為虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草屬(SaxifragaL.)多年生草本植物，在我國主要分布于青海、甘肅、四川、云南及西藏等地，其生境多為海拔2 700～5 300 m的高山草甸、灌叢和石隙[4]，是青藏高原高寒草甸的重要組成部分，對維護該地區(qū)的生態(tài)平衡發(fā)揮著重要的作用。此外，山地虎耳草還具有藥用價值，其花入藥，可治頭痛、神經(jīng)痛等。隨著分子生物學技術和分析方法的發(fā)展，DNA分子標記已廣泛應用于虎耳草屬植物的系統(tǒng)發(fā)育學和譜系地理學研究[5～11]，以揭示北極和高山地區(qū)植物的分化模式。研究表明，山地虎耳草是虎耳草屬山羊臭組(Saxifragasubsect.CiliataeHaw.)中較為年輕的一個物種，其居群分化歷史小于5百萬年甚至更短[6]，可能具有更復雜的遺傳結構和第四紀冰期進化歷史。

簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)或微衛(wèi)星(microsatellite)是一類由幾個核苷酸(2～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中，并利用重復序列的重復次數(shù)在同一物種不同基因型間的差異來揭示物種的長度多態(tài)性[12～14]。微衛(wèi)星作為一種共顯性表達分子標記，具有數(shù)量多，長度短，分布廣且均勻，多態(tài)性高，易于檢測等優(yōu)點，廣泛應用于動植物遺傳多樣性分析，系統(tǒng)發(fā)育，遺傳圖譜構建及分子育種研究等[15～17]。近年來，基于高通量測序對青藏高原地區(qū)高山植物的遺傳多樣性研究也越來越多，例如唐古特紅景天[18]、藍玉簪龍膽[19]和西川紅景天[20]等，但是關于虎耳草屬植物還鮮有報道。

本研究基于山地虎耳草的高通量測序結果，利用MISA(MicroSatellite)軟件搜索該物種的SSR位點，通過分析其微衛(wèi)星重復序列特征，為山地虎耳草SSR標記的開發(fā)和遺傳多樣性檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

山地虎耳草(S.sinomontana)采集于青海省玉樹藏族自治州玉樹縣小蘇莽鄉(xiāng)(32°34′20.7″N，97°12′41.6″E，4 880 m)。將野外采集的活體材料置于室內種植68天，再采取同一叢植株上的葉片，放入冷凍管中，用液氮處理約15秒后放入-80℃冰箱保存。憑證標本保存于中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測、文庫構建與測序

從山地虎耳草的葉片材料中提取100 μg總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的降解程度以及是否有污染，用Nanodrop初步檢測RNA的純度，最后分別選擇Qubit和Agilent 2100來精確定量RNA濃度并檢測其完整性。

樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集山地虎耳草的mRNA。之后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、DNA polymeraseⅠ及RNase H合成雙鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進行末端修復，加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads對其片段大小進行選擇。最后進行PCR擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol·L-1)，以保證文庫質量。

庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求混池后用Illumina HiSeqTM2000進行測序。

1.2.2 質量評估與拼接

對所得的數(shù)據(jù)進行質量評估，包括測序錯誤率分布檢查；A/T/G/C含量分布檢查；對測得的原始讀序(Raw reads)進行過濾：去除帶接頭(adapter)的和N比例大于10%的reads，去除低質量的reads，得到干凈的讀序(Clean reads)后，再用Trinity(版本：v2012-10-05；參數(shù)設置：min_kmer_cov為2，其它參數(shù)為默認參數(shù))[21]對得到的Clean reads進行拼接，并取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene，以此進行后續(xù)分析。

1.2.3 SSR的篩選和統(tǒng)計分析

以組裝出來的Unigene作為參考序列，使用MicroSatellite(MISA；版本：1.0；默認參數(shù)；http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對Unigene進行SSR檢測、篩選和分析。檢索標準同時包括精確型(perfect)及復合型(compound)SSR重復單元[22]，各重復微衛(wèi)星類型重復次數(shù)設定如下：兩堿基(di-nucleotide repeats，DNRs)至少重復6次，三堿基(tri-nucleotide repeats，TNRs)至少重復5次，四堿基(tetra-nucleotide repeats，TTNRs)至少重復5次，五堿基(penta-nucleotide repeats，PTNRs)至少重復5次，六堿基(hexa-nucleotide repeats，HXNRs)至少重復5次。并利用Excel(版本：Microsoft office 2016；默認參數(shù))軟件對SSR的類型、數(shù)量及發(fā)生頻率等進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 山地虎耳草轉錄組測序結果

對于RNA-seq技術，其測序錯誤率會隨著測序序列長度的增加而升高[23～24]，且單個堿基位置的測序錯誤率一般低于1%。山地虎耳草高通量測序獲得94 855 756個Raw reads，過濾后獲得90 311 228個Clean reads，占Raw reads的95.21%，單堿基錯誤率為0.035%，Q30值為88.98%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基的42.39%。

對山地虎耳草的Raw reads進行處理后，用Trinity軟件對所得的Clean reads進行組裝，最終獲得176 110個Transcripts和63 763個Unigene，并對二者的長度進行統(tǒng)計(圖1)，其中在拼接得到的Transcripts中N50為1 708，N90為465；在拼接得到的Unigene中N50為1 295，N90為276，其總的核苷酸數(shù)分別為189 919 691個、46 218 250個。

圖1 拼接后的Transcript與Unigene長度分布圖Fig.1 The length distribution of Transcript and Unigene after assemblage

2.2 山地虎耳草SSR頻率及其分布

采用MISA對Unigene進行SSR檢測，共檢出含有SSR的序列為7 700條，發(fā)生頻率為12.08%，其中6 454條序列含有單個SSR，1 246條序列含有1個以上的SSR。此外，共檢測出4 622個SSR，包括4 098個完全型SSR和524個復合型SSR，其發(fā)生頻率為7.25%(檢測出的SSR數(shù)量與總序列數(shù)目的比值)。從分布情況來看，山地虎耳草轉錄組序列中平均每10.00 kB出現(xiàn)一個SSR。

對SSR類型進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，二至六核苷酸重復類型均有出現(xiàn)，其種類較為豐富，但各類型出現(xiàn)的頻率和分布的平均距離相差較大。其中三核苷酸重復類型的SSR含量最多，占總SSR的55.50%；其次為二核苷酸重復類型，所占比例為30.23%；其他類型(四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和復合核苷酸重復)所占比例較小，分別為2.25%、0.41%、0.28%和11.34%，總計14.28%。從分布情況來看，不同重復基元SSR分布的平均距離差別較大，其中三核苷酸重復最多，出現(xiàn)頻率為4.02%，每條SSR分布的平均距離為18.02 kB，六核苷酸重復最少，出現(xiàn)頻率為0.02%，平均距離為3 355.25 kB(表1)。

表1山地虎耳草SSR序列的出現(xiàn)頻率

Table1FrequencyofSSRsequencesofS.sinomontana

重復基元類型Repeat type數(shù)量Number比例Proportion(%)頻率Frequency(%)平均距離Average distance(kB)二核苷酸Di-nucleotide139730.232.1933.08三核苷酸Tri-nucleotide256555.504.0218.02四核苷酸Tetra-nucleotide1042.250.16444.41五核苷酸Penta-nucleotide190.410.032432.54六核苷酸Hexa-nucleotide130.280.023355.25復合Compound52411.340.8288.20合計Total46221007.2510.00

注：比例.各核苷酸SSR在總SSR中所占比例；頻率.含有SSR的序列數(shù)目與總序列數(shù)目的比值；平均分布距離.序列總長度與SSR數(shù)目之比值 下同。

Note:Proportion. Proportion in all SSRs; Frequency. The percentage of SSR number in all sequences; Average distance. Ratio of total sequence length and SSR number The same as below.

2.3 山地虎耳草SSR基元類型和比例

在山地虎耳草轉錄組4 098個完全型SSR中共發(fā)現(xiàn)了110種重復基元， 其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基元分別有6、30、42、19和13種，占總SSR的比例范圍為0.02%～11.27%。

表2 山地虎耳草轉錄組中不同SSR序列的出現(xiàn)情況

在二核苷酸重復基元中，AG/TC(521個)出現(xiàn)次數(shù)最多，為二堿基的優(yōu)勢重復單元，占二核苷酸重復基元SSR總數(shù)的37.29%，其次為AT/TA(346個，占24.77%)、CT/GA(292個，占20.90%)、AC/TG(131個，占9.38%)、CA/GT(101個，占7.23%)，CG/GC(6個，0.43%)。其中，AG/TC也是所有2～6核苷酸重復基元中數(shù)量最多的SSR，占總SSR的11.27%。三核苷酸重復基元中，AAG/TTC(233個)出現(xiàn)頻率最高，占三核苷酸重復基元的9.08%，即三堿基的優(yōu)勢重復基元，其次為CTT/GAA(202個，占7.88%)、AAC/TTG(180個，占7.02%)、AGA/TCT(164個，占6.39%)。四核苷酸重復類型中，AAGA/TTCT(8個)出現(xiàn)頻率最高為7.69%，其次是AGAA/TCTT和CAAA/GTTT，二者均為6個，出現(xiàn)頻率均為5.77%，AACA/TTGT(5個，占4.81%)，其他類型出現(xiàn)頻率較低。五核苷酸和六核苷酸中各重復基元的個數(shù)均為1，出現(xiàn)頻率普遍偏低，分別占相應重復類型的5.26%、7.69%(表2)。

2.4 山地虎耳草SSR重復次數(shù)分布

在SSR中，基元重復次數(shù)差異而引起的位點長度變化是產(chǎn)生SSRs位點多態(tài)性的主要原因[25～26]。通過對山地虎耳草4 098個完全型SSR進行分類統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)隨著重復次數(shù)的增加，SSR數(shù)量逐漸減少。且山地虎耳草SSR重復次數(shù)大部分分布在5～10次的較低重復次數(shù)基元中，共4 036個SSRs，占總SSR的98.49%，是山地虎耳草SSR的重要重復部分；11次、12次和14次為一般重復次數(shù)基元，分布有61個SSRs，占總SSR的1.49%；20次以上為較高重復次數(shù)基元，本研究中只出現(xiàn)了50次的重復，且僅含1個SSR。在5～11次重復中，發(fā)現(xiàn)重復基元以5次出現(xiàn)的頻率最高，有1 640個，占總SSR的40.02%。其次為6～8次重復，分別占總SSR數(shù)量的31.67%、16.42%、5.76%(圖2)。

圖2 山地虎耳草轉錄組SSR重復次數(shù)分布Fig.2 The distribution of repeat number of SSR in transcriptome of S.sinomontana

據(jù)統(tǒng)計，二核苷酸基元重復次數(shù)類型最多，有8種，其分布為6～12次和50次，共1 397個，其中6～9次重復為主要類型，共1 258個，占二核苷酸基元的90.05%；三核苷酸基元重復次數(shù)類型次之，有5種，其分布為5～8次和14次，共2 565個，以5～7次重復為主要類型，共2 536個，占三核苷酸基元的98.87%；四、五、六核苷酸基元的重復次數(shù)分布分別是5～9、5～7和5～9次，其中5次重復最多。在這五種核苷酸基元中，隨著重復次數(shù)的增加，SSR數(shù)量所占比例都有逐漸減少的趨勢(圖3)。

圖3 山地虎耳草轉錄組SSR不同重復類型的重復次數(shù)分布Fig.3 The distribution of repeat number of SSR for different repeat types in transcriptome of S.sinomontana

在所有堿基中二核苷酸重復基元的重復次數(shù)類型多，跨度大，其中AG/TC跨度最大，重復次數(shù)類型為8種，其次是AT/TA和CT/GA，重復次數(shù)類型均為7種，AC/TG和CA/GT為6種，而CG/GC重復次數(shù)類型最少，僅有2種；三核苷酸重復基元的重復次數(shù)類型和跨度次之，其中ATT/TAA跨度最大，重復次數(shù)類型為5種，其余有15種重復基元均出現(xiàn)了4種重復次數(shù)類型，占三核苷酸總重復基元的50%；四核苷酸重復基元中僅有14種重復基元出現(xiàn)了兩種重復次數(shù)類型，占四核苷酸總重復基元的33.33%，其余的重復基元僅有1種重復次數(shù)類型；在五核苷酸和六核苷酸重復基元中，均只有1種重復次數(shù)類型出現(xiàn)。

2.5 山地虎耳草SSR基元長度分布及其多態(tài)性

山地虎耳草EST-SSR基元長度區(qū)間為12～100 bp，其中最大的片段長度為二核苷酸重復50次(100 bp)的SSR。從整體來看，其分布范圍較為集中，主要在12～30 bp(4 090個，占99.80%)，大于30 bp的SSR數(shù)量較少(8個，占0.20%)。在所有SSR中，最多的為15 bp長度的SSR(1 529個，占37.31%)，并且均為5次重復的三核苷酸基元，其次為18、12、21 bp的基元長度，分布情況分別為760個(18.55%)、627個(15.30%)、355個(8.66%)(圖4)。

圖4 山地虎耳草轉錄組SSR基元長度分布Fig.4 SSR motif length distribution in transcriptome of S.sinomontana

表4山地虎耳草轉錄組SSR不同重復類型的基元長度分布

Table4ThedistributionofmotiflengthofSSRfordifferentrepeattypesintranscriptomeofS.sinomontana

重復類型Repeat type長度Length(bp)SSR數(shù)量Number of SSRsSSR所占百分比Percent of total SSR(%)二核苷酸Di-nucleotide1262744.881431522.551620814.89181087.7320785.5822533.792470.5010010.07三核苷酸Tri-nucleotide15152959.611865225.422135513.8424281.094210.04四核苷酸Tetra-nucleotide208581.73241716.352810.963610.96五核苷酸Penta-nucleotide251789.473015.263515.26六核苷酸Hexa-nucleotide30969.233617.694217.6954215.38

研究發(fā)現(xiàn)，當SSR基序長度大于等于20 bp時其多態(tài)性較高，長度在12～20 bp時多態(tài)性中等，而長度在12 bp以下時多態(tài)性極低[27]。本研究篩選得到的山地虎耳草轉錄組SSR的長度均大于等于12 bp，其中12～19 bp的SSR有3 439個(83.92%)，這些SSR具有中等多態(tài)性；而大于等于20 bp的SSR有659個(16.08%)，這些SSR具有較高的多態(tài)性，所以推測本研究中山地虎耳草轉錄組SSR的多態(tài)性均在中等以上。此外，研究發(fā)現(xiàn)高級基元SSR的多態(tài)性普遍比低級基元的低[28]。本研究中二核苷酸和三核苷酸基元占總SSR的96.68%，在長度大于等于20 bp的SSR中，包含低級基元二核苷酸、三核苷酸共523條，占長度大于等于20 bp的所有SSR的79.36%，表明大部分山地虎耳草轉錄組SSR具有高多態(tài)性潛能(表4)。

3 討論

本研究從山地虎耳草轉錄組63 763個Unigene中檢測出了4 622個SSR，平均分布距離為1/10.00 kB，與其他檢索二至六核苷酸重復基元SSR(即不包含單核苷酸的SSR)的植物相比，山地虎耳草轉錄組SSR的平均分布距離明顯高于冷蒿(1/18.46 kB)[29]、地黃(1/23.08 kB)[30]、杜仲(1/26.13 kB)[31]和馬鈴薯(1/40.06 kB)[32]等，與藍玉簪龍膽(1/9.97 kB)[19]、菊花(1/10.64 kB)[33]相差較小，但低于唐古特紅景天(1/8.52 kB)[18]、紅白忍冬(1/7.49 kB)[34]和刺梨(1/1.68 kB)[35]。由此表明，山地虎耳草轉錄組中SSR的數(shù)量比較豐富。此外，山地虎耳草轉錄組中SSR出現(xiàn)頻率為7.25%，與唐古特紅景天(7.1%)[18]的出現(xiàn)頻率較為接近，高于冷蒿(2.61%)[29]和藍玉簪龍膽(6.12%)[19]。出現(xiàn)這種差異可能與物種選擇、組裝方法、篩選軟件、SSR搜索的標準(如SSR重復基元的類型、重復次數(shù)和長度等)及分析方法有關。

研究表明，大多數(shù)植物的SSR主要重復基元類型是二核苷酸和三核苷酸，但是主導重復基元的類型有所不同[36～37]。本研究發(fā)現(xiàn)，山地虎耳草轉錄組SSR的優(yōu)勢基元是三核苷酸重復，占總SSR的55.50%，其次為二核苷酸重復，占總SSR的30.23%，這與冷蒿[29]、唐古特紅景天[18]、藍玉簪龍膽[19]等植物的優(yōu)勢基元結果相一致。但在杜仲[31]、紅白忍冬[34]和芝麻[38]等植物中二核苷酸重復占主導地位，在川西獐牙菜[36]、燈盞花[37]和半夏[39]等植物中二核苷酸和三核苷酸重復共同為主導類型。以上這種主導重復基元的差別可能與物種的差異有關。有研究表明三核苷酸、六核苷酸SSR重復基序的突變情況，可能是一種有利于植物進化的突變[40]，在山地虎耳草中以三核苷酸SSR為主體的分布可能是自然選擇的結果。此外，有研究指出轉錄區(qū)的三核苷酸基序對自然選擇機制表現(xiàn)出積極選擇作用，在編碼區(qū)由于受到重大突變壓力的影響而存在豐富的核苷酸重復基序[40～43]。即當植物表現(xiàn)出某些抗逆性時三核苷酸重復分布較為豐富。我們推測，隨著第四紀冰期氣候的反復波動，該物種產(chǎn)生了相應的抵御與適應機制，并形成了豐富特殊的三核苷酸重復結構。

被子植物和蕨類植物主要以AG/CT為二核苷酸的優(yōu)勢基元，而裸子植物以AT/AT為優(yōu)勢基元；雙子葉植物、蕨類植物和少數(shù)單子葉植物以AAG/CTT為三核苷酸的優(yōu)勢基元[29]。在山地虎耳草的SSR中，二核苷酸重復基元以AG/TC(521，37.29%)為優(yōu)勢重復類型，三核苷酸重復基元中以AAG/TTC(233，9.08%)為優(yōu)勢重復類型，這與地黃[30]、馬鈴薯[32]、刺梨[35]等研究結果相類似。范三紅[44]等認為這種占優(yōu)勢的重復基元可能與其編碼相應蛋白質的使用頻率較高有關。

GC含量作為堿基序列的重要特征之一，反映了基因的結構、功能和進化信息，GC分布不均會導致基因不同，GC含量序列不同其性質和功能也有差異[45]，而且在大多數(shù)植物中GC重復基元很少出現(xiàn)，例如在唐古特紅景天[18]和紅白忍冬[34]等植物中均未發(fā)現(xiàn)該重復基元，但在山地虎耳草轉錄組SSR中檢測到了6個GC重復基元，這種現(xiàn)象在大豆[14]、刺梨[35]、川西獐牙菜[36]中也均有出現(xiàn)。此外，多個研究指出GC重復基元可能與某特定的功能相關，SSR序列中GC含量的增加會使某些氨基酸序列的增加而獲得某些特定功能，如脅迫抗性、轉錄調控、信號轉導等[22,46]。對于山地虎耳草來講，其適應青藏高原高、寒、旱環(huán)境的特性是否與GC重復單元有關還需要后期研究來加以探討。

SSR位點多態(tài)性主要是由基元的重復次數(shù)和堿基數(shù)不同來決定的[39]。在山地虎耳草轉錄組SSR中二核苷酸重復基元的重復次數(shù)類型多，跨度大，其中AG/TC跨度最大，重復類型次數(shù)為8種，從6～12次，最高達50次，三核苷酸重復基元中ATT/TAA跨度最大，重復次數(shù)類型為5種，四、五、六核苷酸重復基元重復次數(shù)類型較少，僅有1～2種。Gao等[47]研究表明重復次數(shù)與SSR的變異呈正相關，所以本研究中二核苷酸SSR應具有更高的多態(tài)性[48]。

綜上所述，通過分析和挖掘山地虎耳草轉錄組序列中SSR的信息，可為今后該物種SSR標記的開發(fā)和篩選奠定生物信息學基礎，使其更合理、更有效地應用于系統(tǒng)發(fā)育學和譜系地理學等研究，為第四紀氣候波動對高山植物的遺傳多樣性影響及其演化歷史提供更有力的證據(jù)。此外，作為國家生態(tài)建設的戰(zhàn)略要地，青藏高原擁有著類型多樣的極端環(huán)境，如高寒缺氧、晝夜溫差大、日照強烈、多風多雪、干旱貧瘠的土壤等，存在極大的脆弱性，所以通過物種遺傳多樣性的研究可以為高原生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供一定的理論基礎和相應的保護策略，進而推動國家“一帶一路”戰(zhàn)略的實施。