阻斷小鼠Mcl-1表達信號通路對BCG感染的影響

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結核分枝桿菌(MTB)是肺結核(TB)的主要致病菌，以呼吸道為主要傳播途徑，機體感染結核分枝桿菌后，有10.0%左右的機會發(fā)展成活動性肺結核[1]。在2016-2020年的結核病全球結核病戰(zhàn)略報告中，中國仍然是30個結核病高負擔國家之一，而且正面臨著嚴重的TB、MDR-TB和TB/HIV混合的復雜局面[2]。我國每年因結核病死亡人數(shù)是其它傳染病總人數(shù)的兩倍，結核病患者總人數(shù)就占全球總數(shù)的11%[3]，已被WHO列為需要特別引起警示的國家之一[4]。更嚴峻的局面是，在2016年全球估算的新發(fā)結核病患者中，有410萬例未被診斷或未被登記，占同年全球新發(fā)病例的39%[2]。漏診問題不僅與當?shù)卦\療條件及患者本身有關，更與當前所用結核病診斷工具的敏感性和特異性不高等問題有關。因此，盡早診斷潛伏結核感染者，合理應用抗結核藥物、控制結核是目前的當務之急。而有研究提出Mcl-1干預是結核潛伏感染防控的一個新方向[5]。故本研究探討了下調(diào)Mcl-1表達的信號通路對BCG感染的小鼠模型的影響，旨在為Mcl-1干預應用于結核病潛伏感染的防控提供更多的方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗所用菌株，動物及阻斷劑 實驗所用BCG菌株由中國藥物生物制品檢定所提供并保存。實驗所用小鼠為8周齡的SPF 級(無特定病原體動物)的健康雌性BALB / c小鼠，重約18±2 g，購買于石河子大學實驗動物中心。所有關于動物的研究及操作都是經(jīng)過實驗前批準的動物倫理委員會(IAEC)的協(xié)議進行的。阻斷劑AG490、PD98059和LY29400的規(guī)格為5 mg。稀釋時將其分別溶解，按試劑說明每支加入0.5 mL的DMSO溶解，稍微搖晃后混合均勻，保存在-20 ℃的冰箱中備用。

1.2主要試劑 10%的胎牛血清購置于美國Thermo公司，PD98059和LY294002購自于美國Sigma公司，1640和DMEM 購自于美國HyClone公司，辣根過氧化物酶(HRP山羊抗兔)購買于北京中杉金橋生物技術有限公司，Tween-80購置于中國天津， TritonX-100購買于中國南京森貝伽生物科技有限公司，Mcl-1 polyclonal Antibody購買于中國北京博奧森生物技術有限公司，其余實驗試劑均取自石河子大學病理實驗室。

1.3 方 法

1.3.1實驗分組 將實驗小鼠分為阻斷劑組，阻斷劑+BCG組和空白對照組，再將AG490+BCG組、PD98059+BCG組、LY294002+BCG組，同時設1 d、3 d、5 d、7 d 共4個時間點，每組每個時間點各設3只小鼠(經(jīng)過預實驗的篩選，時間點的選擇是根據(jù)Mcl-1的表達水平確定；實驗中小鼠數(shù)量是根據(jù)收集并提取的小鼠腹腔巨噬細胞的數(shù)量確定)。阻斷劑注射劑量為100 μg/只(注射劑量為實驗組前期篩選所得)[6]。

1.3.2結核分枝桿菌感染小鼠模型構建 室溫下，在生物安全柜內(nèi)，用蘇通培養(yǎng)液與生理鹽水的混合物(0.5 mL;體積比為3∶1)來稀釋細菌，取100 μL細菌稀釋液涂抹在改良羅氏培養(yǎng)基上。在2～3周后，滅菌接種環(huán)取羅氏培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好的結核分枝桿菌菌落，置于滅菌的磨菌器中，加入少量的含有0.05%的Tween-80的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。將細菌懸液按照麥氏比濁法的標準調(diào)整至1.0×107菌落(CFU)/毫升。將0.3 mL的菌懸液通過小鼠腹腔注射的方式注射到對應分組的小鼠體內(nèi)[7]。將感染后的小鼠置于生物安全三級實驗室內(nèi)，IVC 籠具中飼養(yǎng)。在上述時間點將阻斷劑AG490、PD98059、LY294002經(jīng)腹腔注入各組小鼠體內(nèi)。

1.3.3小鼠腹腔巨噬細胞的收集與提取 在室溫在，于上述不同的時間點，將各組小鼠脫頸處死后，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，置于超凈臺中；用無菌的鑷子將小鼠下腹部皮膚提起撕開，完全暴露出腹膜；提起腹膜，用5 mL注射器向小鼠腹腔中注入5 mL 1640培養(yǎng)基，反復按摩腹部約10 min，避開腸和脂肪，不同的方向反復抽吸數(shù)次并收集所有吸出的腹腔液；將其在1 200 r/min條件下離心5 min，棄上清，PBS液洗滌1次，用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將細胞重懸；將收集處理好的細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，貼壁細胞即為小鼠腹腔巨噬細胞[8-9]。

1.3.4TUNEL技術檢測細胞凋亡 將各組小鼠于上述不同時間提取并培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細胞。在室溫下，將其固定于4%的多聚甲醛(pH 7.4)上，固定約15 min，PBS沖洗3次5 min后，加入0.1% Triton X-100裂解細胞，放在冰上約8 min，PBS沖洗3次5 min。按照TUNEL試劑盒說明操作，凋亡的細胞被TUNEL反應混合物標記出來，TUNEL陽性細胞的數(shù)量被觀察到。

1.3.5結核分枝桿菌菌落計數(shù)(CFU) 將收集提取的腹腔液放入離心機中，6 000 r/min離心20 min，去上清后，加入 1 mL 1% Triton X-100 對巨噬細胞進行裂解，顯微鏡下觀察巨噬細胞全部裂解后(約 10 min)，加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基(含 10% 胎牛血清)終止裂解，微型振蕩器上振蕩混勻約5 min，分別進行10-2、10-3和10-4倍稀釋，最終接種于羅氏培養(yǎng)基上。 每個稀釋濃度涂抹3個平板，置于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，21 d后對其菌落進行計數(shù)。

1.3.6細胞免疫化學檢測Mcl-1的表達 將收集并提取的小鼠腹腔巨噬細胞制成細胞涂片，于4 ℃固定在4%多聚甲醛過夜。PBS洗涂片2次后， 10%的胎牛血清中放置30 min,然后將其在4 ℃抗體孵育過夜。一抗為兔抗鼠Mcl-1，濃度為1∶1 000，二抗為PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物，濃度為1∶200。在室溫下，使用streptavidinper氧化酶復合物孵育30 min，在黑暗中應用3′-氨基芐苯胺3～5 min。然后用蘇木素和伊紅(H&E)清洗和復染。兩個病理學家進行了免疫組織化學分析，Mcl-1表達的亞細胞位置(核和胞質(zhì))被記錄在400×放大。參照文獻[10]，以陽性和負染色的巨噬細胞計數(shù)，并以Mcl-1陽性巨噬細胞的百分比表示。

1.3.7HE染色觀察小鼠臟器的變化 在小鼠被處死后，立即將其肺、肝、脾、腎取出，固定于10%的福爾馬林中，并用石蠟包埋。經(jīng)過95%乙醇和無水乙醇進行脫水處理后，用二甲苯進行30 min的處理。然后,石蠟包埋、切片、脫蠟處理后，分別用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇依次脫水5 min。最后，通過蘇木精和伊紅著色。顯微鏡下觀察和評估每個圖像中存在的炎癥水平，炎癥區(qū)會比非炎癥區(qū)染得更濃。由于不同的成分，細胞質(zhì)表現(xiàn)出不同的顏色，從而觀察到細胞或組織的組成和病變。

1.3.8小鼠臟器指數(shù)測定 在上述時間點解剖小鼠，立即摘取小鼠的肝、脾、肺、腎進行精密稱重和測量。臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)×100%，用臟器的重量與動物體重的比值表示感染臟器的病變程度，即臟器重量指數(shù)，則該指數(shù)愈大，表示病變程度愈重。

2 結 果

2.1阻斷Mcl-1蛋白信號通路促進了小鼠腹腔巨噬細胞凋亡 由于調(diào)控Mcl-1表達的信號通路有3條，不同阻斷劑對小鼠巨噬細胞凋亡的誘導效果有何差異呢？因此，我們應用TUNEL技術檢測了阻斷劑AG490、PD98059、LY294002阻斷Mcl-1表達的信號通路后小鼠腹腔巨噬細胞的凋亡率。而在本研究中，由于實驗前期研究發(fā)現(xiàn)阻斷劑處理后第5 d作用效果最好[6]，因此本實驗僅分析了阻斷劑處理后第5 d對小鼠巨噬細胞的影響。TUNEL結果顯示，與對照組相比，BCG感染組巨噬細胞的凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-9.048,P<0.05;圖1A;表1)。阻斷劑AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠后，與未感染組相比，小鼠腹腔巨噬細胞凋亡率均呈現(xiàn)不同程度的升高(t=-7.076,t=-10.662,t=-8.994,P<0.001)，其中阻斷劑PD98059的巨噬細胞凋亡率顯著高于AG490和LY294002，差異具有統(tǒng)計學意義(F=40.621,P<0.001;圖1A)。

注：(A) *P<0.05 為抑制劑處理組與未處理組相比, #P<0.05為感染組與未感染租相比；(B) *P<0.05 為 BCG感染組與PD98059處理的BCG感染組相比圖1 抑制劑處理的BCG感染的小鼠腹腔巨噬細胞的凋亡率和菌落計數(shù)Fig.1 Apoptosis rate and CFU in inhibitors treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG

2.2阻斷劑PD98059作用減少了巨噬細胞內(nèi)結核桿菌的數(shù)量 為了判斷阻斷Mcl-1表達的信號通路對小鼠巨噬細胞內(nèi)結核分枝桿菌清除的效果，我們檢測了阻斷劑PD98059處理后小鼠巨噬細胞內(nèi)BCG的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)結果顯示，與未處理感染組相比，阻斷劑PD98059處理后小鼠巨噬細胞內(nèi)BCG的數(shù)量顯著減少(t=3.392,P<0.001;圖1B)，而且比處理前減少了約58%(處理前為4.3×107，處理后為1.8×107)。

2.3阻斷劑PD98059處理抑制了Mcl-1的表達 考慮到阻斷劑的應用不同程度增加了宿主巨噬細胞的凋亡率，而 MAPK信號通路阻斷劑PD98059比PI-3K和JAK / STAT通路阻斷劑誘導更多的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡，因此，我們推測MAPK信號通路是結核感染小鼠巨噬細胞時調(diào)控Mcl-1表達的主要通路。因而我們通過細胞免疫化學檢測了不同阻斷劑應用下Mcl-1的表達。細胞免疫化學數(shù)據(jù)結果顯示，感染了BCG的小鼠腹腔巨噬細胞中，Mcl-1的染色呈現(xiàn)陽性表達(表1)。用阻斷劑AG490、 LY294002處理的H37Ra感染的小鼠腹膜巨噬細胞中Mcl-1的表達受到抑制，而阻斷劑PD98059處理組Mcl-1的表達受到明顯抑制。這些結果證實了我們之前的猜測，與BCG感染組相比，阻斷劑PD98059處理BCG感染的小鼠腹腔巨噬細胞后，Mcl-1的表達顯著降低，其陽性細胞只達到30%(表1)。

表1 抑制劑處理的BCG感染的小鼠巨噬細胞中Mcl-1的表達和凋亡率
Tab.1 The expression of Mcl-1 and apoptosis rate in inhibitors-treated mouse peritoneal macrophages infected with BCG

時間N組別凋亡率(x±s, %)Mcl-1陽性率(%)53Control0.32±0.01053BCG0.80±0.02a10053AG490+BCG0.87±0.02ab9053PD98059+BCG1.28±0.01abc3053LY294002+BCG1.20±0.03abcd70

注:aP<0.05 表示與空白對照組相比；bP<0.05 表示與BCG感染組相比；cP<0.05 表示與AG490+BCG組相比；dP<0.05 表示與PD98059+BCG組相比；eP<0.05表示與LY294002+BCG組相比。

圖2 阻斷劑AG490、 PD98059和LY294002處理的BCG感染的小鼠臟器組織化學變化Fig.2 Histological changes in BCG-infected mice organs treated with the inhibitors AG490, PD98059, LY294002

2.4Mcl-1信號通路抑制劑處理減輕了結核感染的小鼠臟器的病理損害

2.4.1BCG感染組肺臟 肺毛細血管輕度淤血(圖2A-b)；AG490+BCG組肺臟：肺毛細血管淤血(圖2A-c)；PD98059+ CG組肺臟：肺毛細血管淤血減輕(圖2A-d)；LY294002+BCG組肺臟：肺毛細血管輕度擴張、淤血(圖2A-e)。

2.4.2BCG感染組肝臟 中央靜脈擴張淤血不明顯，匯管區(qū)淋巴細胞浸潤不明顯(圖2B-b)；AG490+BCG組肝臟：中央靜脈擴張淤血，部分區(qū)肝細胞輕度增大，胞漿細顆粒狀紅染，匯管區(qū)少量淋巴細胞浸潤(圖2B-c)；PD98059+BCG組肝臟：中央靜脈輕度擴張淤血，匯管區(qū)淋巴細胞浸潤減少(圖2B-d)；LY294002+BCG組肝臟：中央靜脈擴張淤血減輕(圖2B-e)。

2.4.3BCG感染組脾臟 脾紅髓淤血水腫，散在出血(圖2C-b)；AG490+BCG組脾臟：脾紅髓淤血水腫、出血(圖2C-c)；PD98059+BCG組脾臟：脾紅髓輕度水腫、出血減少(圖2C-d)；LY294002+BCG組脾臟：脾紅髓水腫，出血程度減輕(圖2C-e)。

2.4.4BCG感染組腎臟 腎小球輕度淤血(圖2D-b)。AG490+BCG組腎臟腎小球和腎間質(zhì)毛細血管和小靜脈部分區(qū)擴張淤血(圖2D-c)；PD98059+BCG組腎臟：腎間質(zhì)毛細血管和小靜脈擴張淤血減輕(圖2D-d)；LY294002+BCG組腎臟：腎間質(zhì)毛細血管和小靜脈擴張淤血，腎小球擴張淤血(圖2C-e)。

2.5阻斷劑PD98059的應用減輕了小鼠臟器病變程度 為了直觀的分析Mcl-1信號通路阻斷劑對小鼠臟器的影響，我們還計算了小鼠肺臟、肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數(shù)。與對照組相比， BCG感染后，各組臟器重量均有不同程度的增加，其中以BCG感染組肺、肝、脾臟器壞死比例減輕最為明顯(t=-14.495,t=9.648,t=-11.013,P<0.001;圖3)，而腎臟的差異較小(t=-2.45,P=0.04)。當阻斷劑 AG490、PD98059、LY294002作用于BCG感染的小鼠模型后，小鼠肺、肝、脾臟器的臟器指數(shù)明顯減少，而腎臟只有PD98059處理組減少;不同干預方式比較發(fā)現(xiàn)，阻斷劑PD98059處理組效果最為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(F=59.24,F=811.134,F=34.091,F=9.543,P<0.05;圖3)。

注：*P<0.05 為抑制劑處理組與未處理組相比, #P<0.05為感染組與未感染組相比圖3 阻斷劑AG490、PD98059和LY294002處理的BCG感染組小鼠臟器指數(shù)變化Fig.3 Viscera index changes of mice in inhibitors AG490, PD98059, LY294002 treated BCG infection group

3 討 論

MTB是一種典型的細胞內(nèi)病原體，可以通過多種機制躲避機體的免疫系統(tǒng)的殺傷和清除，從而影響宿主細胞(單核細胞-巨噬細胞)的調(diào)控。它還能改變巨噬細胞的功能，抑制細胞凋亡通路的激活，從而使病原體復制、繁殖并生活在巨噬細胞內(nèi)[1]。因此，有效的控制結核的潛伏感染是目前結核病預防與控制的主要策略。如若能夠激活宿主巨噬細胞正常的凋亡過程，則可以有效消除結核的潛伏感染，并能夠防止結核病在體內(nèi)的持續(xù)傳播。而研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白骨髓細胞白血病-1(Mcl-1)與宿主巨噬細胞的這一凋亡過程密切相關[11]。

而近年來，對Mcl-1基因的研究主要集中在與腫瘤相關的疾病[12]。因此，將該基因用于控制結核病感染將是一個新的挑戰(zhàn)。在當前的研究中，TUNEL的結果發(fā)現(xiàn)，應用阻斷劑AG490、PD98059和LY294002抑制Mcl-1的表達后，導致小鼠巨噬細胞凋亡率呈現(xiàn)不同程度的增加(圖1)。而且阻斷劑PD98059處理后，小鼠巨噬細胞內(nèi)存活的結核桿菌的菌落數(shù)量顯著減少(圖1)。此結果說明將Mcl-1干預引入到結核病的預防與控制中是可行的，而且它將是很有潛力的一個應對結核潛伏感染的預防和控制策略。

不同的組織和細胞中，調(diào)控Mcl-1表達的信號通路有差異，主要通過JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)、MAPK(Mitogen activated protein kinase)和PI-3K(Phosphatidy linositol 3-kinase)等胞內(nèi)信號通路的激活來調(diào)控[13-15]。在本實驗中，應用JAK/STAT、MAPK和PI3K信號通路阻斷劑下調(diào)Mcl-1的表達，都增加了BCG感染的小鼠巨噬細胞的凋亡。但細胞免疫化學的結果顯示，當應用MAPK信號通路阻斷劑處理BCG感染的小鼠腹腔巨噬細胞時，Mcl-1的表達被明顯的抑制了(表1)。此結果說明MAPK通路為結核感染的小鼠巨噬細胞中調(diào)控Mcl-1表達的主要通路。

MAPK信號通路其亞族主要包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 (ERK1/2)，P38，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK5等[16]，多種細胞因子誘導Mc1-1的轉錄上調(diào)都依賴于MAPK的活性[17]。PI3K(磷脂酰肌醇激活) 信號通路通過影響下游多種效應分子發(fā)揮其抗凋亡作用[18]。JAK/STAT信號轉導通路阻斷劑AG490可阻斷多種細胞因子引起的JAK2/STAT3的磷酸化激活，繼而阻斷JAK/STAT信號轉導路徑。結核桿菌感染巨噬細胞后，誘導其生成大量的TNF-α，使得Caspases酶活性增強以啟動細胞凋亡。而Caspases酶系可以分解Mcl-1導致其上調(diào)。阻斷劑抑制Mcl-1的表達后，TNF-α的生成受到抑制以拮抗Mcl-1的下調(diào)。MAPK通路通過三條支路共同發(fā)揮作用，以致于Mcl-1的表達顯著下調(diào)；而JAK/STAT和PI3K途徑阻斷后Mcl-1的表達較少。因此，MAPK通路阻斷后造成更多的Mcl-1表達，誘導更多的小鼠腹腔巨噬凋亡。

為了證實Mcl-1引入結核感染的有效性，我們觀察和分析了BCG感染后小鼠的肺臟、肝臟、脾臟和腎臟的臟器指數(shù)和HE染色變化。HE染色的結果發(fā)現(xiàn)，阻斷劑應用后能夠有效改善小鼠肺臟、肝臟和脾臟的病理損傷，特別是在阻斷劑PD98059處理后(圖3)。除此之外，阻斷劑的應用還能夠減輕小鼠臟器的病變程度。然而，阻斷劑應用后對腎臟的影響較小，主要原因可能是腎臟發(fā)生結核所需要的病程時間應當較長，而本實驗的研究時間較短，并不能觀察到腎臟的明顯病理改變。

綜上所述，阻斷Mcl-1表達的信號通路可以有效促進小鼠巨噬細胞凋亡，減少宿主巨噬細胞內(nèi)潛伏的結核桿菌的存活，改善小鼠臟器因結核感染造成的病理損傷，減輕病變程度。而MAPK通路為結核感染的小鼠巨噬細胞凋亡調(diào)控的主要通路。此研究為結核病潛伏感染和持續(xù)感染提供了一個新的方向。然而，對于MAPK信號通路的研究僅僅是初步的，其各個支路如何發(fā)揮調(diào)控作用將在后續(xù)的實驗中進行深入探討。