按經(jīng)選穴針刺對失眠大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA表達的影響

吳雪芬，袁建菱，鄭雪娜，郭鑫，陳小麗，劉麗，魏歆然

失眠是指經(jīng)常不能正常睡眠，主要表現(xiàn)為入睡困難，睡眠時間短，睡眠質(zhì)量差，早醒和日間功能障礙等。睡眠是人體隨自然界變化而出現(xiàn)的周期性靜息狀態(tài)，對維持生命至關(guān)重要，具有提高生命活力、健康指數(shù)、促進腦和身體恢復(fù)功能的作用[1]，睡眠功能發(fā)生障礙則會出現(xiàn)失眠，失眠患者覺醒時通常伴有腦功能降低[2-3]。正常人每天有7～8h處于睡眠狀態(tài)?，F(xiàn)代研究表明[4]，睡眠是大腦中調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期的多個中心參與的神經(jīng)化學(xué)過程。而下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)是調(diào)控睡眠/覺醒的主要結(jié)構(gòu)之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神經(jīng)元對睡眠-覺醒周期具有雙重調(diào)整作用，既可以促進覺醒，又是產(chǎn)生非快眼動睡眠(non rapid eye movement sleep,NREM)的必備條件，同時還能協(xié)同去甲腎上腺素(norepinephrine,noradrenalin,NE)觸發(fā)快動眼睡眠(rapid eye movement,REM)，故5-HT是睡眠與覺醒的樞紐之一[6]。5-HT受體在睡眠-覺醒機制中也有重要作用，5-HT 1a受體可減少REM睡眠且增加REM潛伏期，5-HT 2a受體具有激發(fā)覺醒的作用[7]。近年來研究表明[8]，針刺治療失眠癥具有良好的療效。臨床上針刺治療失眠癥的選穴方法多樣，正確的腧穴配伍是提高針刺療效的關(guān)鍵因素之一，不同的腧穴配伍方式與針刺治療失眠的療效密切相關(guān)[9-10]。本研究通過固定按部選穴(百會)，對比配伍本經(jīng)穴、他經(jīng)穴、非經(jīng)非穴對失眠大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體表達的影響，探討針刺治療失眠癥的療效機制及按經(jīng)選穴針刺對腧穴配伍效應(yīng)影響的特異性，為臨床針灸治療失眠癥的選穴原則及配穴方法提供一定的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物與分組：無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)SD雄性大鼠60只，8～9周齡，體質(zhì)量220～250g/只。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號：SCXK(湘)2013-0004。正式實驗開始前，先將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分12籠飼養(yǎng)，每籠5只，圈養(yǎng)于動物中心實驗室。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度23℃～26℃，室內(nèi)濕度45%～65%。飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、百會+神門穴組、百會+三陰交穴組、百會+非經(jīng)非穴組，每組12只。②主要化學(xué)試劑和儀器：DL-4-氯苯基丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA)，戊巴比妥鈉，碳酸氫鈉片，氫氧化鈉片，阿拉伯膠，動物型超純水機，PH精密試紙，電熱水恒溫杯，RNA提取試劑，逆轉(zhuǎn)錄核糖核酸酶抑制劑，Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)，隨機引物(Random primers)、瓊脂糖(agarose)，熒光定量試劑盒，Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green qPCR)，實時熒光定量PCR擴增儀，756型紫外分光光度計，ABI 7300 Real-Time PCR System，超低溫冰箱，UVP凝膠掃描系統(tǒng)，微量移液器，DYZ-22A型雙恒定時電泳儀，DYY-III橋式電泳儀，臺式高速冷凍離心機，華佗牌一次性使用無菌針灸針。

1.2 方法 ①動物模型制備：正式實驗開始前，大鼠均自由進食飼料、水，保持飼養(yǎng)籠內(nèi)墊料干燥，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后稱體重并記錄；造模方法參照馮浩[11]，除空白組外，其余各組于第8天腹腔注射PCPA混懸液，每日1次，連續(xù)注射2d，制造失眠模型大鼠。具體操作如下：首先配置所需濃度和劑量的PCPA混懸液，PCPA臨用前按大鼠體重500mg/kg用量，用事先配置好的弱堿性生理鹽水(PH：7～8)和10%阿拉伯膠攪拌，用超聲機超聲15min后，制成PCPA混懸液(100mg/ml)備用。用注射器取與大鼠體重相對應(yīng)的混懸液劑量，于下腹部旁開1cm處，按針尖與體表成45°角，針尖朝上進針，進針后上挑針頭以避開臟器。回抽注射器，若無回血，則緩慢注入；若見回血現(xiàn)象，應(yīng)停止注射，出針后再調(diào)整方向后進針。同時，空白組采用同樣的操作方法，腹腔注射等體積弱堿性生理鹽水。造模成功的判定：失眠大鼠會出現(xiàn)晝夜節(jié)律缺失、日間與夜晚皆活動不斷、對外界刺激異常敏感、煩躁不安等相關(guān)癥狀。首次注射PCPA36h后，觀察模型組大鼠的生理狀態(tài)，結(jié)合采用經(jīng)典的戊巴比妥鈉翻正實驗，觀察空白組大鼠與模型組大鼠的睡眠潛伏期及睡眠總時間的差異，進行失眠模型評價，模型組與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示造模成功。②戊巴比妥鈉實驗[12]：預(yù)實驗測得戊巴比妥鈉按照大鼠體重35mg/kg劑量為引起100%大鼠睡眠的最小閾劑量，按50mg/ml濃度溶于生理鹽水后進行腹腔注射，提起大鼠尾巴，將大鼠腹部朝上放在平臺上，記錄大鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間。以大鼠反正反射消失為睡眠，以大鼠翻正反射恢復(fù)為覺醒，注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失之間為潛伏期，翻正反射消失到覺醒為睡眠持續(xù)時間。③治療方法：造模完成后，于第2次注射PCPA的第24h后，開始對實驗大鼠進行干預(yù)?？瞻捉M大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。模型組大鼠予以仰臥位束縛于鼠板上，只捆綁，不進行針刺，每日1次， 30min，連續(xù)7d，每天捆綁結(jié)束后正常進食。各針刺組大鼠選穴參考大鼠穴位定位[13]。百會+神門穴組選取“百會穴”、雙側(cè)“神門穴”，百會+三陰交穴組選取“百會穴”、雙側(cè)“三陰交穴”，百會+非經(jīng)非穴組選取“百會穴”、雙側(cè)非經(jīng)非穴點[14]，非經(jīng)非穴點參照成都中醫(yī)藥大學(xué)所制定的選穴方法，此點在非經(jīng)脈循行路線上及非穴位所在部位。將大鼠仰臥位束縛于鼠板上，定穴后局部剪毛，絡(luò)合碘消毒，采用1寸、30號的華佗牌針灸針進行針刺，留針時間30min，每10min行針1次，行針時間1min，不提插、只捻轉(zhuǎn)，行平補平瀉手法，捻轉(zhuǎn)幅度為180°，頻率60次/min，第30min時，在行針結(jié)束后出針，每日1次，每天治療后正常進食，連續(xù)治療7d。穴位定位及針刺方法：百會穴：位于頂骨正中處，從后向前平刺20mm；神門穴：位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1mm；三陰交穴：位于后肢內(nèi)踝尖直上10mm，直刺5mm；非經(jīng)非穴點：位于肘內(nèi)側(cè)，肘尖與腋窩連線中點，直刺5mm。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) ①生理檢測：行為學(xué)觀察：每天觀察大鼠精神狀態(tài)、動作靈敏性、反應(yīng)敏捷性、晝夜節(jié)律，毛發(fā)光澤度，體重變化以及活動度、飲食量、飲水量、毛發(fā)、糞便等一般情況。②生化檢測：末次行為學(xué)檢測后禁食不禁水12h，腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉，各組大鼠在冰臺上斷頭處死，取下丘腦，稱取重量，加入一定量的PBS，PH：7.4，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿\用實時熒光定量PCR方法檢測下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體的表達：采用Trizol總RNA提取試劑盒提取各組大鼠下丘腦總RNA；Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后測定下丘腦中的5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA的表達量。以actin作內(nèi)參，采用2-△Ct分析法分析大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體基因的相對表達量：循環(huán)閾值(△Ct)=Ct樣品均值-Ct內(nèi)參均值，標(biāo)本基因/內(nèi)參基因=2-△Ct，熒光定量PCR引物：內(nèi)參基因β-actin引物序列為：上游5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,下游5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′；5-HT 1a引物序列為：上游5′-ATCTCGCTCACTTGGCTCAT-3′，下游5′-GTGGTCCTTGCTGATGGTG-3′，擴增片段長度為111bp；5-HT 2a引物序列為：上游5′-AACGGTCCATCCACAGAGAG-3′，下游：5′-ATGGGCACCACATTACAACA-3′,擴增片段長度為129bp：PCR擴增條件95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 20s，72℃ 30s，共45個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠死亡情況 實驗過程中共有7只大鼠死亡，其中模型組4只，百會+三陰交穴組1只，百會+非經(jīng)非穴組2只。

2.2 生理檢測結(jié)果 造模后36h評價，與空白組比較，模型組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失、白天活動不停、對外界的聲、光等刺激異常敏感，煩躁不安，興奮性增高、攻擊性增強、毛硬粗糙、毛豎起無光澤，大便色澤灰白，持續(xù)觀察一周期間體重增加緩慢、飲食量明顯減少、飲水量明顯增多，以上失眠癥伴隨癥狀提示造模成功。3個治療組于治療3d后開始表現(xiàn)恢復(fù)晝夜節(jié)律，飲水量較前減少，飲食量較前增多，異常情緒較前緩解，大便恢復(fù)正常黃褐色等。

2.3 造模前后戊巴比妥鈉睡眠實驗結(jié)果比較 大鼠首次注射PCPA 36h后，進行戊巴比妥鈉睡眠實驗，空白組與模型組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(35mg/kg，50mg/ml)，進行失眠模型評價，模型組與空白組睡眠潛伏期與睡眠總時間的差異：空白組造模前后睡眠潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義，睡眠總時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組大鼠注射戊巴比妥鈉后，與造模前相比，造模后睡眠潛伏期顯著長于造模前(P<0.05)，睡眠總時間顯著短于造模前(P<0.05)，提示造模成功。見表1。

表1 造模前后戊巴比妥鈉睡眠實驗的比較

與造模前比較，aP<0.05

2.4 按經(jīng)選穴針刺對失眠大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠下丘腦5-HT 1a 受體mRNA表達量顯著降低(P<0.01), 5-HT 2a 受體mRNA表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，百會+神門穴組5-HT 1a受體mRNA表達量明顯升高(P<0.01)，5-HT 2a受體mRNA表達量明顯降低(P<0.01)；與百會+神門穴組比較，百會+三陰交穴組及百會+非經(jīng)非穴組5-HT 1a受體mRNA表達量明顯減少(P<0.05，0.01)，百會+三陰交穴組5-HT 2a受體mRNA表達量無顯著性差異,百會+非經(jīng)非穴組5-HT 2a受體mRNA表達量明顯升高(P<0.05)；與百會+三陰交穴組比較，百會+非經(jīng)非穴組5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA表達量無明顯差異。見表2。

表2 治療后各組大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA表達的比較

與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與百會+神門穴組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.5 治療結(jié)束后戊巴比妥鈉睡眠實驗結(jié)果 治療7d后，于末次治療當(dāng)晚20:00進行戊巴比妥鈉翻正實驗測試睡眠潛伏期及睡眠時間。睡眠潛伏期：與空白組比較，模型組延遲(P<0.05)；與模型組比較，3個治療組均提前(P<0.05)；3組間比較無明顯差異；睡眠時間比較：與空白組比較，模型組減少(P<0.05)；與模型組比較，百會+神門穴組延長(P<0.05)，百會+三陰交穴組、百會+非經(jīng)非穴組無顯著變化；治療組之間比較，百會+神門穴組長于百會+三陰交穴組、百會+非經(jīng)非穴組(P<0.05)；百會+三陰交穴組、百會+非經(jīng)非穴組之間無明顯差異。見表3。

表3 治療結(jié)束后大鼠睡眠潛伏期、睡眠時間的比較

與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與百會+神門穴組比較，cP<0.05

3 討論

導(dǎo)致失眠的病因多而復(fù)雜，隨著現(xiàn)代生活的節(jié)奏加快，失眠癥的發(fā)病率逐年上升，長期失眠使人們的正常生活受到很大的影響，且易并發(fā)其他疾病。大量的古代及現(xiàn)代研究證實，針灸治療失眠癥療效顯著，在臨床上運用越來越多，備受研究者關(guān)注。飲食、情志、勞倦、體虛等因素均是導(dǎo)致失眠的病因，上述因素導(dǎo)致邪氣擾動心神或心神失于濡養(yǎng)、溫煦，心神不安，陰陽失調(diào)；其病機關(guān)鍵在于神失所主、心神不安；病位主要在心，且與脾、肝、腎等密切相關(guān)。

百會穴位于頭頂，屬督脈穴，頭為諸陽之會，百脈之宗。楊上善說“胃流津液滲入古空，變而為髓，頭中最多，故為海也。是腎所生，其氣上輸腦蓋百會穴，下輸風(fēng)府也”。百會穴為各經(jīng)脈之氣會聚之處，調(diào)節(jié)機體的陰陽，具有醒腦開竅、鎮(zhèn)靜安神、升陽舉陷等作用。“心主血脈，又主神明，為君主之官”，心藏神，神在人體的生命活動中占有重要地位，神門為心經(jīng)之原穴，具有鎮(zhèn)靜安神之效，心神得安，則能入眠。三陰交屬足太陰脾經(jīng)，可通調(diào)三陰經(jīng)之經(jīng)氣，從而使陰可斂陽。由此可見，以上穴位與失眠癥有著及其密切的關(guān)系，故本實驗以百會穴作為固定按部選穴，治療各組在此基礎(chǔ)上分別配以不同經(jīng)脈穴位，即按經(jīng)選穴，神門穴為心經(jīng)之原穴，某一臟腑或經(jīng)脈發(fā)生病變時，遵循“不盛不虛，以經(jīng)取之”的取穴原則，故在本研究中，神門為本經(jīng)穴，三陰交為他經(jīng)穴，為說明經(jīng)穴是否具有特異性，故另設(shè)一組“百會+非經(jīng)非穴”作為對照組，使得實驗設(shè)計更為合理。

自1969年Jouvet和Koella提出了5-HT致眠學(xué)說后，至今大量研究證實5-HT是改善失眠癥狀不可替代的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，繼而發(fā)現(xiàn)，中縫核不同部位的5-HT能神經(jīng)元與非快速眼動睡眠(non rapid eye movement sleep, NREMS)的產(chǎn)生和維持有關(guān)，也可觸發(fā)快速眼動睡眠(rapid eye movement, REM)，分泌不足時能引起大腦皮層興奮和抑制功能的紊亂，進而導(dǎo)致睡眠時相慢波睡眠和快波睡眠發(fā)生了紊亂[15]，且中縫核尾端的5-HT神經(jīng)元恰是藍斑中后部快波睡眠的“觸發(fā)機制”[16]，故5-HT是睡眠與覺醒的樞紐之一。 最新的5-HT受體分類是根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、第二信使及藥理作用的不同分為七類(5-HT 1-7)，每個類別又分為多種亞型。其中與睡眠相關(guān)性最高的是5-HT 1a、5-HT 2a受體[17]，5-HT 1a受體激動劑可升高腦內(nèi)5-HT含量，從而減少REM睡眠且增加REM潛伏期以達到治療失眠的目的，5-HT 2a受體具有激發(fā)覺醒的作用[7]。PCPA是一種5-HT生成抑制劑，可以耗竭中樞神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT[18]。故采用PCPA造模是目前常用的制造失眠模型大鼠的方法。5-HT 2a受體拮抗劑可通過增加SWS和NREMS從而減少覺醒次數(shù)，且對REMS無影響[19]。因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為5-HT 1a受體激動劑與5-HT 2a受體拮抗藥物可用于治療失眠。Sookoian等[20]通過實驗顯示，冬眠期松鼠大腦皮層及海馬的5-HT 1a受體表達增加，5-HT 1a受體的mRNA水平在松鼠冬眠期處于相對較高的水平。余軍等[21]證實針刺治療對失眠小鼠有延長睡眠時間、縮短睡眠潛伏期等促眠作用，其機理可能是使PCPA失眠大鼠中縫背核(NRD)降低的5-HT含量升高、大鼠NRD的5-HT 1a受體表達增強、5-HT 2a受體表達減弱。許峰[9]采用中藥干預(yù)失眠大鼠，可通過影響下丘腦及海馬內(nèi)5-HT 1a、5-HT 2a受體表達引起下丘腦及海馬內(nèi)5-HT含量的改變，從而起到治療失眠的作用。羅本華[19]采用3種針法治療PCPA化失眠大鼠，證實針刺可增強失眠大鼠海馬內(nèi)5-HT 1a受體表達，并減弱5-HT 2a受體表達。本實驗采用PCPA混懸液造模方法并結(jié)合戊巴比妥鈉睡眠實驗對模型大鼠進行評價，發(fā)現(xiàn)大鼠造模后睡眠潛伏期顯著多于造模前，而睡眠總時間顯著少于造模前，結(jié)合造模后大鼠生理情況的變化，如晝夜節(jié)律消失，對光、聲敏感，興奮性和攻擊性增強，飲食量減少，飲水量增多等，提示造模成功。各針刺組大鼠經(jīng)針刺治療后，下丘腦5-HT 1a受體表達量均有升高趨勢，5-HT 2a受體表達量均有降低趨勢，且大鼠情緒、晝夜節(jié)律、飲食量、飲水量等都有一定程度的恢復(fù)，治療結(jié)束后結(jié)合戊巴比妥鈉實驗，結(jié)果提示，與模型組相比，治療組睡眠潛伏期均縮短，百會+神門穴組睡眠時間延長，且長于百會+三陰交穴組、百會+非經(jīng)非穴組，說明5-HT 1a受體表達量的升高和5-HT 2a受體表達量的降低可延長大鼠睡眠潛伏時間，并一定程度延長睡眠時間，在改善睡眠方面顯示出一定療效，起到安神鎮(zhèn)靜的作用，且實驗結(jié)果與以上研究結(jié)果一致[17，21-22]。非經(jīng)非穴組5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA表達較模型組雖無明顯差異，但治療后睡眠潛伏期提前，也顯示出一定的治療效果，說明除5-HT 1a、5-HT 2a受體水平外，可能還存在其他改善睡眠的機制，需要進一步探討。該實驗表明針刺治療失眠癥的療效確切，其改善睡眠的機制可能是通過調(diào)節(jié)失眠大鼠下丘腦5-HT 1a、5-HT 2a受體mRNA的表達實現(xiàn)的。各針刺治療組之間比較，針刺“神門穴”、“三陰交穴”、“非經(jīng)非穴”均可起到一定的治療作用，神門穴療效最佳，三陰交穴及非經(jīng)非穴療效次之。

綜上所述，不同的腧穴配伍方式，療效也不相同，本實驗通過固定取穴“百會”，再分別配以不同經(jīng)脈腧穴(心經(jīng)、脾經(jīng)、非經(jīng)非穴)，設(shè)計3個治療組，對比本經(jīng)穴、他經(jīng)穴、非經(jīng)非穴的療效差異，按經(jīng)選穴分組明顯。根據(jù)本實驗結(jié)果，針刺穴位改善睡眠的療效確切，且神門穴可作為臨床治療失眠的必要穴位，三陰交穴及非經(jīng)非穴也表現(xiàn)出一定的療效，可作為符合辨證的參考穴位。同時本實驗表明，5-HT 1a、5-HT 2a受體與睡眠有密切的關(guān)系，按經(jīng)選穴針刺是腧穴配伍效應(yīng)的影響因素之一。