MCN技術(shù)在毒性檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究

張茂榮，黃碧捷，涂志睿，廖 俊

(江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056)

1 引言

生態(tài)環(huán)境部于2019 年4 月首次發(fā)布《水質(zhì) 致突變性的鑒別 蠶豆根尖微核試驗(yàn)法》(HJ 1016-2019)，該標(biāo)準(zhǔn)2019 年9 月起正式實(shí)施，標(biāo)志著經(jīng)過近40 年在我國(guó)的研究與應(yīng)用，蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)(以下簡(jiǎn)稱：MCN技術(shù))終以國(guó)標(biāo)的形式正式進(jìn)入到環(huán)境監(jiān)測(cè)中。1982 年，Degrassi等正式建立了MCN技術(shù)方法體系。隨后，陳光榮、王英彥、金波等研究者做了大量的基礎(chǔ)應(yīng)用研究工作，促使我國(guó)于1986 年就將蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)列入到《環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》生物監(jiān)測(cè)(水環(huán)境)部分。2002 年，該技術(shù)又編入《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)，用于水與廢水遺傳毒性的規(guī)范檢測(cè)[1]。EPA(美國(guó)環(huán)保署)也利用MCN技術(shù)對(duì)環(huán)境致癌物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，建立了毒性數(shù)據(jù)庫(kù)并建議在全世界推廣[2]。1980～2018年，CNKI中關(guān)于根尖微核研究的文獻(xiàn)有1016篇[3]，2008年開始該領(lǐng)域的研究趨于平穩(wěn)。隨著HJ 1016-2019的正式實(shí)施，必然帶來新一輪熱點(diǎn)的MCN技術(shù)的相關(guān)研究與應(yīng)用。

2 MCN技術(shù)原理與優(yōu)勢(shì)

微核是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的小核[4]，是細(xì)胞受外界脅迫后由有絲分裂后期散失著絲粒的染色體片斷產(chǎn)生，微核的發(fā)生頻率與細(xì)胞染色體發(fā)生損傷、變異的頻率顯著相關(guān)。蠶豆細(xì)胞DNA含量多，染色體數(shù)目少且大，對(duì)外源誘變物敏感且易于觀察[5]，是經(jīng)典的遺傳學(xué)研究材料。蠶豆根尖微核的突變形成主要來源于穩(wěn)定性染色體畸變[6](易位、到位、缺失等)。以蠶豆微核的變化做為檢測(cè)指標(biāo)的MCN技術(shù)具備成本低、試驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[7]。MCN技術(shù)的核心就是要建立待檢物與受試物間良好、穩(wěn)定和明確的效應(yīng)-劑量關(guān)系。已有研究表明：輻射，聲波，重金屬，無機(jī)非金屬，疊氮化物、苯環(huán)等有機(jī)污染物、抗菌素、真菌霉素等微生物因素都能誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞形成微核，重復(fù)性好，已在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，例如用于水(淡水、海水、工業(yè)廢水、地下水、核廢水、自來水)污染監(jiān)測(cè)，土壤污染監(jiān)測(cè)，空氣污染監(jiān)測(cè)，毒物(農(nóng)藥、藥品、礦塵、洗滌劑、香煙等)致突變性檢測(cè)，食品安全等多方面。

世界上至今已發(fā)展了百余種方法檢測(cè)污染物的遺傳毒性。1975年建立并不斷發(fā)展完善的可用于污染物致突變性的沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))已被廣為采用。ISO(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織)發(fā)布了《水質(zhì) 水和污水的遺傳毒性測(cè)定 沙門氏菌/微粒體試驗(yàn)》(ISO 16240-2005)并執(zhí)行至今。我國(guó)也相繼發(fā)布了《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)》(GB 15193.4-1994、GB 15193.4-2003，均已廢止)、《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法(第14部分：細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn))》(GB/T 15670.14-2017)等標(biāo)準(zhǔn)。Ames試驗(yàn)也能用于環(huán)境監(jiān)測(cè)中的致突變性檢測(cè)，相比于Ames試驗(yàn)，MCN技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于所需儀器和實(shí)驗(yàn)室條件簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)，對(duì)待檢物要求低，不需要純化處理，受限因素更少，操作要求不高。在以復(fù)合污染和未知痕量污染物為特征的現(xiàn)實(shí)各環(huán)境介質(zhì)條件下，只需要判斷其突變性，而不需要嚴(yán)格確定具體某污染物的突變性下限值。因此，MCN技術(shù)成為了我國(guó)環(huán)保部門頒布的環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域采用的首個(gè)國(guó)標(biāo)致突變性檢測(cè)方法。筆者認(rèn)為：Ames試驗(yàn)和MCN技術(shù)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)中致突變性檢測(cè)并不沖突，分別從動(dòng)物/微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞兩方面染色體的變化揭示了污染物的遺傳毒性特征，起到相互補(bǔ)充和相互驗(yàn)證的作用。

3 MCN技術(shù)中致突變性的鑒別方法

MCN技術(shù)直接得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是微核千分率(MCN ‰)。污染程度或致突變性的判斷的是以實(shí)驗(yàn)中得到的不同的微核千分率數(shù)值為基礎(chǔ)?！端h(huán)境生物檢測(cè)技術(shù)規(guī)范：蠶豆根尖微核技術(shù)》采用MCN污染指數(shù)(PI)區(qū)間劃分方法判斷試樣的污染程度。污染指數(shù)(PI=MCN試樣/MCN空白)按不同的數(shù)值區(qū)間，如0～1.5、1.5～2、2～3.5以及3.5以上，分別對(duì)應(yīng)基本無遺傳性污染，輕度污染，中度污染以及重度污染。PI值大于1.5預(yù)示著該污染物具有了一定的遺傳毒性。該傳統(tǒng)方法判定致突變性是有偏差的，空白組、對(duì)照組和試樣組中的蠶豆都可能隨機(jī)產(chǎn)生數(shù)量相對(duì)較多的微核，僅用平均值的方式并沒有考慮到隨機(jī)因素，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)收支撐，導(dǎo)致本身就是隨機(jī)概率的致突變性的結(jié)論容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。HJ 1016-2019并未采用傳統(tǒng)的污染指數(shù)法，而是采用了MCN試樣與實(shí)驗(yàn)室歷史累積MCN空白相比較，再通過非參數(shù)檢驗(yàn)法(推薦Kruskal-Wallis方法)計(jì)算判斷兩者間是否存在顯著性差異相結(jié)合的判定方法。該方法既考量了微核千分率數(shù)值變化的直觀體現(xiàn)，又考慮到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性因素，使得結(jié)論更科學(xué)，更可信。

4 MCN技術(shù)的新應(yīng)用

MCN技術(shù)應(yīng)用廣泛，用于重金屬、有機(jī)物、藥物的遺傳毒性的研究被大量報(bào)道。隨著MCN技術(shù)的不斷成熟發(fā)展，無論是否已知待測(cè)物的成分及其配比，尤其是對(duì)痕量污染物的綜合遺傳毒性效應(yīng)判斷上，都可以利用MCN技術(shù)。近5年來，MCN技術(shù)在藥物、日常生活用品、食品/添加劑、自然水體及特殊工業(yè)廢水和場(chǎng)地污染監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用上顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

4.1 MCN在藥物遺傳毒性檢測(cè)中的應(yīng)用

MCN技術(shù)已被應(yīng)用到檢測(cè)強(qiáng)力霉素(DOX)、環(huán)丙沙星(CIP)、三氯卡班(TCC)、卡馬西平(CBZ)、阿莫西林、四環(huán)素類抗生素(如：土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四環(huán)素(TTC))和磺胺類獸藥(磺胺嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)和磺胺甲噁唑(SMZ))等藥物遺傳毒性上。以上藥物都能誘發(fā)微核效應(yīng)。例如：DOX、CIP、TCC和CBZ在12.5～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均顯著(P<0.05)高于對(duì)照組，PI值均大于3.5，屬于重度損傷，微核千分率隨濃度的增大均呈先增后減的趨勢(shì)[8]。OTC、CTC和TTC在0.1～1.6 mmol/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均高于3.33‰，PI值均大于1.5，且差異顯著，微核千分率隨濃度的增大呈先減后增的趨勢(shì)[9]。SD、SMM和SMZ在1～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，微核千分率均在20 ‰左右，顯著高于空白組(6.5‰)，微核千分率隨濃度變化不明顯[10]。隨著新型藥物的不斷研發(fā)及使用，MCN在藥物遺傳毒性檢測(cè)中的應(yīng)用會(huì)越來越多，將為藥物安全使用和藥物進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究提供支撐。

4.2 MCN在日常生活用品毒性檢測(cè)中的應(yīng)用

MCN技術(shù)在檢測(cè)日常生活用品(尤其是個(gè)人護(hù)理品)領(lǐng)域應(yīng)用很廣。大量研究集中在對(duì)家用洗滌劑(衣物洗滌劑(洗衣粉、洗衣液等)、清潔用品(洗潔精、潔廁劑等)和日化用品(洗發(fā)水、洗面奶、沐浴露、精油等)，染發(fā)膏/劑(海娜粉)，洗甲水，蚊香液(氯氟醚菊酯)，塑料袋浸濾液，增塑劑(鄰苯二甲酸二丁酯)等的檢測(cè)中。例如：許媛媛[11]等研究發(fā)現(xiàn)3種不同染發(fā)膏分別在0.10、1.00、4.00 g/L處理濃度時(shí)的最高PI值分別為139.39、95.32、63.63，即使是稀釋10倍后，PI值也大于3，有較強(qiáng)的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。李瑩[12]等將3種蚊香液制成25 %、50%和75%的體積濃度時(shí)，PI值均在2～5之間，75%體積濃度的蚊香液微核千分率為(2.5±0.65)‰顯著高于空白組的(0.5±0.29)‰。不同的塑料袋浸濾液制備溫度對(duì)誘導(dǎo)的微核千分率影響較大，其隨溫度的增加而增大。常溫條件下，白色食品塑料袋和紅色普通塑料袋浸提液微核千分率較小，隨浸提溫度升高，快遞包裝袋浸濾液產(chǎn)生較大的遺傳損傷[13]。賴柯華[14]等發(fā)現(xiàn)0～0.2 mg/L的薰衣草精油誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞的微核千分率和脂質(zhì)過氧化呈正相關(guān)；超過0.2 mg/L時(shí)細(xì)胞正常的生理代謝和應(yīng)激反應(yīng)受到影響。對(duì)日常生活用品的MCN技術(shù)應(yīng)用研究的報(bào)道均發(fā)現(xiàn)了靈敏的微核反應(yīng)和相對(duì)應(yīng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即使不完全清楚這些物品具體組分和含量，也能判斷其遺傳毒性，并且能運(yùn)用到幾乎全部的日常生活用品的檢測(cè)中。

4.3 MCN在食品/添加劑檢測(cè)中的應(yīng)用

食品和食品添加劑安全問題是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究問題之一。MCN技術(shù)能有效、快速的鑒別食品/添加劑的遺傳毒性效應(yīng)。普洱茶、泡面、蘇丹紅、香煙煙霧水、辣條、明礬(硫酸鉀、硫酸鋁)、食物水提取液(西芹、大蒜)等均有利用MCN技術(shù)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。普洱茶濃度小于5.0 g/mL時(shí)，微核效應(yīng)不明顯；大于8.0 g/mL時(shí)，微核數(shù)和PI值均顯著增大，飲用低濃度的茶水更有益于身體健康[15]。香煙煙霧水溶液在0.5～8支/mL的濃度范圍內(nèi)，大蒜的微核千分率隨著濃度的增加而極顯著增加，PI值均大于3.5，能在0.5支/mL的低濃度和較少處理時(shí)間(12 h內(nèi))就對(duì)植物遺傳物質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷[16]。明礬在0.1～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，微核千分率隨濃度呈先上升后下降的趨勢(shì)，濃度為0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到峰值[17]。0.1～1.0 g/mL西芹水提液對(duì)蠶豆微核千分率的產(chǎn)生沒有誘導(dǎo)作用，西芹水提液具有抑制遺傳毒性的作用，可作為抗突變保健品進(jìn)一步開發(fā)利用[18]。

4.4 MCN在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

5 應(yīng)用MCN技術(shù)對(duì)武漢城區(qū)自然水體的監(jiān)測(cè)

5.1 樣品處理及實(shí)驗(yàn)方法

水樣采集：分別在2020年11月(秋季)和2021年5月(春季)，對(duì)武漢市的三角湖(SJ)、龍陽(yáng)湖(NY)、南太子湖(NTZ)、內(nèi)沙湖(NS)、舉水河(JS)、道觀河(DG)、北湖(BH)、菱角湖(LJ)和湯遜湖(TX)采集水體樣本，樣本為混合樣，每個(gè)樣品測(cè)定3次、6個(gè)平行，取平均值。空白樣品測(cè)定20次取平均值。

實(shí)驗(yàn)方法：按HJ 1016-2019在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。記錄各水樣微核千分率(MCN試樣)；計(jì)算其污染指數(shù)(PI=MCN試樣/MCN空白)和顯著性差異的統(tǒng)計(jì)量值(H值，Kruskal-Wallis法)，若 H≥3.84(顯著性水平α=0.05)，反之則差異不顯著。當(dāng)MCN試樣≤實(shí)驗(yàn)室歷史累積MCN空白上限(參考值6.6‰)，則該試樣不存在致突變性(-，陰性)；當(dāng)MCN試樣>MCN空白上限，且本次MCN試樣較MCN空白顯著增加/非顯著增加，則該試樣存在致突變性(+，陽(yáng)性)/疑似存在致突變性(±，疑似陽(yáng)性)。

5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)的空白值MCN空白為2.9‰；MCN空白上限取HJ 1016-2019中參考值6.6‰。將春、秋兩季9個(gè)自然水體混合樣監(jiān)測(cè)和計(jì)算結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示：無論是春季還是秋季，選取的9個(gè)自然水樣點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)其致突變性，水質(zhì)狀況良好。相比于空白，各水樣均發(fā)生了微核反應(yīng)，PI值范圍是1.01～1.44之間，均劃分為基本無遺傳性污染。H值均顯示與空白無顯著性差異。南太子湖和內(nèi)沙湖比較接近臨界值，應(yīng)引起關(guān)注。

表1 武漢市9個(gè)自然水體的MCN檢測(cè)結(jié)果

6 結(jié)論與展望

通過應(yīng)用MCN技術(shù)對(duì)武漢市自然水體采樣、測(cè)試分析結(jié)果表明：所有的水體樣本都發(fā)生了微核反應(yīng)，PI值均小于1.5，未顯示出遺傳毒性和致突變性。蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)已在污染物檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域展示著強(qiáng)大的生命力。隨著HJ 1016-2019的發(fā)布與實(shí)施，該技術(shù)逐漸做到了規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和系列化，是較好的鑒定遺傳毒性的試驗(yàn)方法。然而，MCN技術(shù)依然只適用于測(cè)試潛在的染色體損傷因子，從植物細(xì)胞傷害推斷到人群健康，必然還存在不確定性和局限性，需要在更微觀的層次上揭示其毒性機(jī)理，在擴(kuò)寬MCN技術(shù)應(yīng)用的同時(shí)，對(duì)其超顯微結(jié)構(gòu)和致突變分子機(jī)制等領(lǐng)域值得深入研究。