分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉強(qiáng)極性農(nóng)藥殘留

何 江，宋 磊，羅先錕

(1.貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽 5500811；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽 550026)

1 引言

茶葉中含有40多種無機(jī)礦物質(zhì)和450多種有機(jī)化合物[1]，具有提神清心、清熱解暑、消食化痰等作用，還對(duì)心腦血管病有一定的藥理功效，因此受到人們的喜愛。我國(guó)是世界上最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)，茶園面積、產(chǎn)量及消費(fèi)量均居世界第一[2]。同時(shí)，我國(guó)也是茶葉出口大國(guó)，茶葉出口為我國(guó)農(nóng)民帶來了經(jīng)濟(jì)收入[3]。長(zhǎng)期以來，為了降低病蟲害對(duì)茶葉的影響，保障茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，采用農(nóng)藥防治茶樹病蟲害成為茶園的一項(xiàng)重要措施[4]。常用極性農(nóng)藥中，如樂果可用于防治小綠葉蟬、茶蚜、介殼蟲等害蟲；氧樂果主要用于防治刺吸式口器的害蟲；敵百蟲主要用于防治茶毛蟲、刺蛾、卷葉蛾等食葉性害蟲；多菌靈可抑制茶樹輪斑病的病原菌生長(zhǎng)；涕滅威是一種高毒殺蟲、殺螨、殺線蟲劑。由于這些強(qiáng)極性農(nóng)藥殺蟲殺菌效果好，能有效的防止茶樹病害蟲的生長(zhǎng)，在茶葉生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。但是，強(qiáng)極性農(nóng)藥使用不當(dāng)會(huì)造成茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo)[5]，影響茶葉的品質(zhì)，損害消費(fèi)者健康，還影響著茶葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。如涕滅威及其代謝物過度使用，其致癌和致突變性可對(duì)環(huán)境和人體健康造成潛在危害[6，7]；長(zhǎng)期食用殘留有多菌靈的食物，經(jīng)消化道吸收后，能引起頭昏腦脹、惡心嘔吐等中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引起肝病和染色體畸變，同時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物神經(jīng)具有一定的毒性作用[8，9]。

茶葉農(nóng)藥殘留的樣品前處理技術(shù)呈現(xiàn)多方向發(fā)展、多個(gè)學(xué)科綜合的新局面。常用的前處理方法有[10～13]：固相微萃取技術(shù)、固相萃取法、基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，它們共同的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高、適用性廣，但試劑的用量大，花費(fèi)的成本高，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。QuEChERS方法是近年來發(fā)展起來的一種樣品前處理技術(shù)，該方法是先將均質(zhì)的樣品用乙腈提取，然后鹽析分層，吸附劑[14](C18、GCB等)凈化，比傳統(tǒng)的凈化方法更為快速簡(jiǎn)易[15]。常用檢測(cè)方法包括生物檢測(cè)技術(shù)、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。UPLC-MS/MS是集UPLC的高分離能力與MS/MS的高靈敏度和高選擇性于一體的強(qiáng)有力分離分析方法，對(duì)復(fù)雜基體中的農(nóng)藥殘留具有很強(qiáng)的定性能力。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)茶葉中強(qiáng)極性農(nóng)藥的檢測(cè)，探索出更適合檢測(cè)茶葉中強(qiáng)極性農(nóng)藥的色譜條件，采用QuEChERS前處理技術(shù)，結(jié)合UPLC-MS/MS法，建立一種更經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)茶葉12種強(qiáng)極性農(nóng)藥的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣品、試劑與儀器

茶葉樣品均來自于市場(chǎng)和茶園抽樣，按照GB 23200.13-2016 進(jìn)行制樣與保存。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)賽默飛世爾公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；無水硫酸鎂(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；乙酸鈉(分析純，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)；醋酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、多菌靈、甲胺磷、噻蟲嗪、敵百蟲、氧樂果、樂果9種標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1000μg/mL，北京壇墨公司)；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

三重四級(jí)桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters Xeve TQ，Waters公司)；渦旋振蕩器(SK-1，上海梅香儀器有限公司)；高速離心機(jī)(HC-3515，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(AX205，瑞士梅特勒托利多公司)；Milli-Q超純水凈儀(美國(guó)Millipore公司)。

單標(biāo)儲(chǔ)備液：甲醇配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、多菌靈、甲胺磷、噻蟲嗪、敵百蟲、氧樂果、樂果單標(biāo)儲(chǔ)備液，于 4 ℃保存。

2.2 樣品前處理

稱取2.00 g茶葉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL純水，渦旋1 min，靜置30 min；加入15 mL 1%醋酸-乙腈和一顆陶瓷質(zhì)子于樣品管中，渦旋1 min，加入6 g MgSO4、1.5 g乙酸鈉，快速震蕩后，渦旋2 min，10000 r/min離心5 min。

固相萃取法：取2 mL上清液過PRiME HLB小柱，收集濾液，UPLC-MS/MS測(cè)定。

QuEChERS法：取6 mL乙腈層加入10 mL離心管中，加入1.2 g MgSO4、400 mg PSA、400mgC18和200mgGCB，渦旋2 min，10000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取2 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃氮吹濃縮近干，加入1 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，用0.22 μm濾膜過濾，UPLC-MS/MS測(cè)定。

2.3 UPLC-MS/MS 測(cè)定條件

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3柱(1.8 μm，2.1×100 mm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min，5% B；3～7 min，70% B；7～9 min，5% B；9～10 min，5% B；流速：0.3 mL/min；外標(biāo)法定量。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；正離子模式；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔反吹氣：50 L/Hr；脫溶劑氣：1000 L/Hr。詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

用甲醇配制濃度為0.2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用保留特性差異大的3種類型色譜柱在同一梯度條件下比較，分別為ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7 μm，2.1×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC柱(1.7 μm，3.0×100 mm)和ACQUITY UPLC HSS T3柱(1.8 μm，2.1×100 mm)。圖1顯示了3種色譜柱的保留時(shí)間，強(qiáng)極性農(nóng)藥在BEH C18柱上的保留時(shí)間最短，大部分強(qiáng)極性農(nóng)藥的保留時(shí)間均在1 min以內(nèi)，保留時(shí)間密集；HILIC柱檢測(cè)得到的色譜圖保留時(shí)間大多在1～2 min，保留時(shí)間也比較密集，其中樂果、甲胺磷的保留時(shí)間均為1.47 min，涕滅威、氧樂果的保留時(shí)間均為1.49 min；強(qiáng)極性農(nóng)藥經(jīng)HSS T3柱的分離，獲得到有效分離，色譜圖峰形都較好。對(duì)比3種色譜柱的檢測(cè)結(jié)果，HSS T3柱分離檢測(cè)的效果最好。強(qiáng)極性農(nóng)藥在BEH C18柱和HILIC的保留時(shí)間都集中在1～2 min，形成離子對(duì)時(shí)容易相互競(jìng)爭(zhēng)，影響定量的結(jié)果，還容易受到基質(zhì)的干擾，并且峰形對(duì)稱性差。HSST3柱是硅膠基體C18柱，能夠增強(qiáng)極性化合物的保留，減弱疏水性化合物的保留，9種化合物的分離效果見圖1中HSS T3色譜圖部分，保留時(shí)間具體是樂果5.76 min、甲胺磷1.54 min、多菌靈5.56 min、涕滅威6.21 min、氧樂果3.29 min、敵百蟲5.38 min、噻蟲嗪5.28 min、涕滅威砜4.85 min和涕滅威亞砜4.27 min；色譜峰峰形對(duì)稱性比前兩種好，積分定量更加準(zhǔn)確。

圖1 9種極性農(nóng)藥在3種色譜柱上的色譜圖

甲醇配制9種藥物濃度0.2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜做一級(jí)質(zhì)譜MS掃描，優(yōu)化毛細(xì)管電壓尋找母離子；優(yōu)化碰撞能量，選擇響應(yīng)高和干擾小的子離子作為定量離子。電離模式、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、碰撞能量及錐孔電壓見表1。

3.2 凈化方法的選擇及優(yōu)化

3.2.1 凈化劑的優(yōu)化

基質(zhì)分散劑C18可以去除茶葉提取液中脂肪、甾醇和維生素等非極性物質(zhì)，降低干擾和減小基質(zhì)效應(yīng)，提高分析結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性；PSA 可有效去除茶葉中脂肪酸、有機(jī)酸和糖類等干擾雜質(zhì)；茶葉樣品經(jīng)提取色素比較重，而GCB可以消除色素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾和質(zhì)譜離子化的影響。按照步驟2.2節(jié)處理茶葉樣品，添加水平為100 μg/kg。另設(shè)置4組不同的吸附劑的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，吸附劑組合分別為400 mg PSA、400 mg C18、400 mg PSA和200 mg GCB、400 mg C18和200 mg GCB，同時(shí)加入1.2 g MgSO4，每組設(shè)置6個(gè)平行樣，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，平均回收率見表2。結(jié)果顯示，凈化劑為PSA和C18對(duì)茶葉基質(zhì)中的所有目標(biāo)農(nóng)藥的平均回收率沒有差異性，大部分目標(biāo)物的回收率均低于70%；而當(dāng)加入GCB時(shí)，茶葉凈化液接近無色，其中甲胺磷、多菌靈、噻蟲嗪、涕滅威砜和涕滅威亞砜回收率增加明顯；PSA、C18和GCB同時(shí)加入時(shí)，9種化合物平均回收范圍為76.48%～99.57%，符合農(nóng)藥殘留分析要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇PSA、C18和GCB組合為茶葉基質(zhì)的凈化劑。

3.2.2 凈化方法的選擇

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)比較了固相萃取法和QuEChERS法的凈化效果，按照步驟2.2節(jié)處理茶葉樣品，添加水平為50 μg/kg，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，平均回收率見表2。數(shù)據(jù)顯示，QuEChERS法和固相萃取法處理后，9種化合物平均回收范圍分別為76.48%～99.57%和63.15%～87.70%，大部分化合物差異不明顯，但敵百蟲、噻蟲嗪和涕滅威砜已經(jīng)明顯低于70%。固相萃取小柱的價(jià)格比較貴，綜合考慮選擇QuEChERS為本實(shí)驗(yàn)的凈化方法。

表2 不同凈化條件下得到的回收率(n=6)

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

在UPLC-MS/MS檢測(cè)復(fù)雜樣品時(shí)，通常會(huì)受到樣品基質(zhì)的干擾，影響目標(biāo)物的離子化，產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)，基質(zhì)效應(yīng)(ME)=基質(zhì)校正曲線斜率/溶劑校正曲線斜率)[17]。溶劑相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和空白茶葉樣品配制相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，UPLC-MS/MS測(cè)定，表3結(jié)果顯示：涕滅威、涕滅威砜、多菌靈、甲胺磷的ME比值在0.8～1.2范圍內(nèi)，為弱基質(zhì)效應(yīng)；樂果、氧樂果、噻蟲嗪、敵百蟲、涕滅威亞砜的ME比值在1.2～1.5或0.5～0.8范圍內(nèi)，為中等基質(zhì)效應(yīng)。茶葉基質(zhì)中9種目標(biāo)物存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，選擇空白茶葉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

表3 空白茶葉的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

3.4 線性范圍、檢出限和定量限

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，濃度范圍在0.005～0.1 μg/mL，UPLC-MS/MS 檢測(cè)，以各組分的色譜峰面積對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，表3數(shù)據(jù)顯示，相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.997，線性關(guān)系良好。檢出限(LOD)以定量離子的3倍以信噪比(S/N=3)計(jì)算，定量限(LOQ)以定量離子的10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算[18]。9種強(qiáng)極性農(nóng)藥的LOD在0.09～1.57 μg/kg，LOQ在0.30～5.22 μg/kg。檢出限和定量限均低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB23200.13-2016《茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜法》中的檢出限及定量限[19]。

3.5 準(zhǔn)確度和精密度

實(shí)驗(yàn)選擇4個(gè)不同濃度水平5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg和100 μg/kg的添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，平均回收率見表4。9種強(qiáng)極性農(nóng)藥的平均回收率在74.47%～101.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)在0.34%～12.71%之間。準(zhǔn)確度和精密度符合《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2386號(hào)》的要求，表明9種強(qiáng)極性農(nóng)藥在茶葉油基質(zhì)中的分析檢測(cè)方法可行。

表4 空白茶葉基質(zhì)中4種不同添加濃度目標(biāo)物的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)市場(chǎng)和茶園上購(gòu)買的5種不同批次的63個(gè)茶葉樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，9強(qiáng)極性農(nóng)藥均未檢測(cè)出。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究得到了適用于檢測(cè)茶葉中強(qiáng)極性農(nóng)藥的色譜條件，采用QuEChERS前處理技術(shù)對(duì)茶葉進(jìn)行簡(jiǎn)單、高效的前處理，用UPLC-MS/MS分析檢測(cè)。本方法步驟簡(jiǎn)單易操作、試劑用量小、回收率好、精密度高，且有效除去茶葉中基質(zhì)干擾，同時(shí)檢出限和定量限滿足于農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。因此，本方法適用于茶葉中涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、氧樂果、樂果、甲胺磷、敵百蟲、多菌靈、噻蟲嗪9種強(qiáng)極性農(nóng)藥的檢測(cè)。