自然殺傷T細(xì)胞在血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓中的作用

侯翠柳 陳 東 來 松 劉 洋 田 翠 楊 慧 王紅霞

原發(fā)性高血壓(primary hypertension, PH)是以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為主要臨床表現(xiàn)的心血管綜合征，通常簡稱為高血壓[1]。高血壓與其他心血管病危險(xiǎn)因素共存，是重要的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，可損傷重要臟器如心、腦及腎的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官功能的衰竭[2]。目前關(guān)于PH的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為是遺傳、環(huán)境及神經(jīng)內(nèi)分泌因素共同作用的結(jié)果。近年來大量研究表明高血壓是一種慢性炎癥性疾病，且越來越多研究表明炎癥反應(yīng)尤其是免疫細(xì)胞在高血壓及其靶器官損害的過程中具有重要的作用，如高血壓和高鹽可促進(jìn)免疫細(xì)胞包括單核/巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞等在血管壁中聚集和活化，產(chǎn)生大量氧自由基(reacive oxygen speaes,ROS)和炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)血管重塑和高血壓發(fā)生[3]。Harrison實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)RAG-1-/-小鼠(缺乏T和B淋巴細(xì)胞)可明顯抑制Ang II 和DOCA-salt誘導(dǎo)的高血壓，通過特異性過繼性T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移可完全恢復(fù)血壓，而B淋巴細(xì)胞沒有上述作用[4]。上述研究表明，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與高血壓的發(fā)生[5]，但何種類型的T淋巴細(xì)胞參與高血壓的發(fā)生目前尚不清楚。

自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells, NKT)細(xì)胞是一類新的T細(xì)胞亞型，既表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)αβ，又表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志的T細(xì)胞亞群。其能識(shí)別由抗原提呈細(xì)胞表面CD1d分子提呈的脂類抗原如(α-GalCer)[6]，因此CD1d的敲除導(dǎo)致NKT細(xì)胞的失活。 NKT細(xì)胞活化后迅速分泌大量細(xì)胞因子從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中發(fā)揮重要的作用[7]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞還參與了多種心血管疾病的發(fā)生，如NKT細(xì)胞調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、其激活保護(hù)心肌細(xì)胞免受柯薩奇病毒B3引起的心肌損傷、拮抗心肌缺血/再灌注和心肌梗死的發(fā)生等[8]，但其在高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過在CD1d基因敲除的小鼠上，采用血管緊張素II灌注14 d建立小鼠高血壓模型，觀察小鼠血壓、血管壁厚度、炎癥反應(yīng)及纖維化及巨噬細(xì)胞的浸潤，探討NKT細(xì)胞在高血壓中的作用及分子機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠，雄性，6 ～8周齡，18～20 g，由北京維通利華公司提供。CD1d基因敲除(CD1d knockout, CD1d ko)購自Jackson Laboratory小鼠(129S2/SvPas)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué) SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。所有研究工作均遵守美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.主要試劑 Angiotensin II、三溴乙醇、麗春紅粉劑、苯胺藍(lán)粉劑、磷鉬酸/磷鎢酸均購于美國Sigma公司；苦味酸、碳酸氫鈉購于北京化工廠；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Progame公司；流式管，計(jì)數(shù)板、CD45-Perpcp抗體、F4/80-BV421抗體購于美國BD公司。

3.主要方法 (1)實(shí)驗(yàn)分組、模型制備及給藥方法：CD1d 基因敲除(CD1d ko)及C57BL/6J野生對(duì)照雄性小鼠(wild type, WT)分別隨機(jī)分為 4 組(每組 8 只)：對(duì)照組WT+ Saline、CD1d ko+Saline；實(shí)驗(yàn)組WT+Ang II、CD1d ko+Ang II。模型制備過程：小鼠稱重，計(jì)算 Ang II(490ng·min-1·kg-1)所需劑量，根據(jù)劑量在超凈臺(tái)下灌泵。用3%的三溴乙醇溶液腹腔注射麻醉小鼠，常規(guī)消毒實(shí)驗(yàn)組小鼠耳后部皮膚，剪開1cm長的切口，將泵(開口端朝向鼠尾側(cè))埋入淺筋膜下層?？p合皮膚，嚴(yán)密觀察小鼠生命體征，待小鼠生命體征平穩(wěn)后隔天用無創(chuàng)鼠尾法監(jiān)測小鼠血壓持續(xù)14 d。

(2)血管取材與染色：小鼠麻醉后打開胸腔進(jìn)行心血管體循環(huán)系統(tǒng)灌注，剪取小鼠胸主動(dòng)脈，用濾紙吸干血管表面的水分，用于提取 RNA的組織用液氮冷凍后保存于 -80 ℃冰箱。用于病理檢查的血管在甲醛中固定，然后石蠟包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行HE和Masson染色。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)：Trizol 法提取小鼠血管組織 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。每個(gè)體系加入 2 μL cDNA 模板、上下游引物各 1 μL 和 SYBR10 μL，配制成 20 μL 的反應(yīng)體系。通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀測定IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA水平。IL-1β 的上游引物為 5’-TTGGGCCT-CAAAGGAAAGAAT-3’，下游引5-TGGGTATT-GCTTGGGATCCA-3’; IL-6 的上游引物為 5’-CCA-GAAACCGCTATGAAGTTCCT-3’，下游5-AGAACCCTGACTACGACCAC-3’; TNF-α 的上游引物為 5’-GCCAACGGCATGGATCTC-3’，下游引物為 5-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGAG-3.

(4)流式細(xì)胞術(shù)：配制血管消化酶，剪取小鼠的整根主動(dòng)脈，修剪血管周圍多余的脂肪組織，然后將血管放到裝有PBS的1.5mL EP管中，置于冰上剪碎小鼠的血管組織，每組的操作盡量保持一致性，隨后將剪碎的血管組織轉(zhuǎn)移至裝有消化酶的EP管中，不斷消化，直至血管組織被完全消化成單細(xì)胞懸液，過濾至新的15mL離心管中，除去其雜質(zhì)。將上述過濾好的血管單細(xì)胞懸液 400g 離心 7min，棄上清，1mL PBS 重懸計(jì)數(shù)。標(biāo)記流式抗體：將流式抗體加入細(xì)胞懸液中，4℃，避光孵育 30min；抗體孵育完成后，400g ，離心 7min，棄上清，加入 1mL PBS 重懸，再 400g， 離心 7min，用 500μL PBS 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析均使用 SPSS 19. 0 軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CD1d敲除加重 AngII灌注誘導(dǎo)的血壓升高 與Saline組相比，Ang II灌注后野生小鼠血壓明顯升高(P<0.05)，而CD1d基因敲除進(jìn)一步增加Ang II灌注引起的血壓升高(P<0.05，圖1)。

圖1 CD1d基因敲除對(duì) Ang II灌注引起血壓升高的影響。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比 較，#P<0.05

圖2 CD1d敲除對(duì) Ang II灌注誘導(dǎo)的血管厚度和炎癥反應(yīng)的影響。A： H&E染色檢測血管壁厚度(×200)；B：定量qPCR檢測血管組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA的表達(dá)水平。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P <0.05

圖3 CD1d敲除對(duì) AngII 誘導(dǎo)的血管纖維化的影響。A：Masson 染色檢測血管組織中膠原沉積情況(×200；)B：及膠原面 積定量分析(右)(n=8)。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P<0.05

2.CD1d敲除加重Ang II誘導(dǎo)的血管壁厚度及炎癥反應(yīng) 與 Saline組比較，Ang II 灌注明顯增加血管壁厚度及炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.05)，而CD1d基因的敲除進(jìn)一步加重Ang II灌注引起的以上變化(圖2)。

3.CD1d敲除加重Ang II誘導(dǎo)的血管壁中膠原的沉積 與Saline組相比，Ang II 灌注明顯增加血管組織中膠原沉積，而CD1d敲除進(jìn)一步加重Ang II 灌注引起的膠原沉積(P<0.05，圖3)。

4.CD1d敲除增加Ang II 誘導(dǎo)的血管壁中巨噬細(xì)胞浸潤 為了明確NKT是否調(diào)節(jié)血管組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，我們應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測了 CD45+F4/80+的巨噬細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明與saline 組相比，Ang II 處理的 WT小鼠的血管中CD45+F4/80+的巨噬細(xì)胞明顯增多，而CD1d敲除進(jìn)一步增加這些細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05，圖4)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang II灌注引起野生小鼠血壓升高、血管壁的厚度增加、炎癥因子mRNA的表達(dá)增加及血管中膠原纖維的沉積增多，而CD1d敲除加重了以上的變化，說明NKT細(xì)胞能夠拮抗Ang II灌注引起的血壓升高；進(jìn)一步本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CD1d敲除進(jìn)一步加重了Ang II灌注引起的巨噬細(xì)胞浸潤。以上結(jié)果表明 NKT細(xì)胞通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的浸潤參與了對(duì)高血壓的調(diào)節(jié)。

圖4 CD1d敲除對(duì) Ang II 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞影響。A：流式細(xì)胞術(shù)分析血管組織中CD45+F4/80+炎性細(xì)胞比率；B：統(tǒng)計(jì)分 析(n=8)。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P<0.05

高血壓的發(fā)生過程涉及動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，其主要病理改變包括血管壁增厚、平滑肌細(xì)胞增生/肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增多和炎癥細(xì)胞聚集。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD1d敲除導(dǎo)致NKT細(xì)胞不能活化，進(jìn)一步加重了Ang II 灌注引起的血壓升高，血管壁厚度增加及膠原的沉積，首次證明了NKT細(xì)胞參與了高血壓的發(fā)生。NKT細(xì)胞激活后可產(chǎn)生Th1(如TNFα和IL-1β)和Th2型(如IL-4和IL-10)的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步影響先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括NK細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、CD4+和 CD8+T 細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的激活。鑒于巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，在維持促炎與抑炎反應(yīng)中起著重要的作用[9]。在脈管系統(tǒng)和腎臟中，巨噬細(xì)胞衍生的ROS和炎癥細(xì)胞因子可以導(dǎo)致內(nèi)皮和上皮功能障礙，造成血管氧化應(yīng)激和鈉排泄的損傷，最終導(dǎo)致高血壓等心血管疾病和腎臟疾病[10]。高血壓的誘因如Ang II、DOCA-salt等可促進(jìn)骨髓來源單核巨噬細(xì)胞增多，造成血管內(nèi)皮的功能障礙[11]。基于此，我們進(jìn)一步探討了NKT細(xì)胞是否通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從而參與對(duì)血壓的調(diào)節(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD1d分子敲除明顯加重了Ang II灌注誘導(dǎo)血管組織中CD45+的炎性細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的增多，從而增加了血管的炎癥反應(yīng)，提示NKT細(xì)胞可以通過減少巨噬細(xì)胞的浸潤而拮抗高血壓的發(fā)生。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CD1d敲除加重Ang II灌注引起的血壓升高、血管重塑包括血管壁厚度的增加和纖維化加重，并且加重了血管組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，說明NKT通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞參與高血壓的發(fā)生。我們的結(jié)果為高血壓的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)，但是NKT細(xì)胞是通過何種方式影響的巨噬細(xì)胞的聚集還有待我們的進(jìn)一步研究。