四唑染色法快速測(cè)定菊芋種子生活力的研究

丁 鵬

（博愛縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 博愛 454450）

菊芋（Helianthus tuberosus）俗名洋姜，菊科，向日葵屬，多年生草本植物［1］。菊芋根系發(fā)達(dá)，可改善土壤的結(jié)構(gòu)，增加孔隙率和水穩(wěn)性團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，且耐旱、耐寒，塊莖能夠在-40～25℃的凍土層內(nèi)安全越冬，適應(yīng)性極強(qiáng)，且不影響出苗［2］。因此，可用于我國(guó)北方干旱、風(fēng)沙區(qū)的土地綠化、防風(fēng)固沙，防止水土流失，且在荒坡地、鹽堿地、城鄉(xiāng)空閑地等處零星或成片種植，能夠綠化環(huán)境、增加經(jīng)濟(jì)收入。菊芋是中等耐堿植物，種植菊芋可降低土壤中的鹽堿量對(duì)改良土壤具有很大的作用［3］。菊芋的營(yíng)養(yǎng)成分中，碳水化合物的78%為菊糖［4］，因此，可用于炒食或腌漬加工成醬菜食用，或?qū)⑵渚仗羌庸こ晒牵崛【凭?、香精等。菊芋也有很?qiáng)的藥用價(jià)值，提取的菊糖可作為利尿劑，用于糖尿病輔助治療，或?qū)K莖搗碎外敷，用以消除腫毒等。此外，菊芋的莖、稈和塊根均可用作飼料，發(fā)展畜牧業(yè)。菊芋特有的花香、花蜜可招引蜜蜂采集，故可人工放養(yǎng)，發(fā)展養(yǎng)蜂業(yè)［5］，是一種極具開發(fā)潛力的半野生資源。

菊芋生產(chǎn)上一般用塊莖繁殖，但隨著菊芋用途的開發(fā)，需要對(duì)其品種質(zhì)量進(jìn)行改良而進(jìn)行雜交育種，但雜交后的種子繁殖時(shí)發(fā)芽率低，嚴(yán)重影響了菊芋用途的開發(fā)，因此，檢測(cè)其雜交育種后種子生活力，探明其發(fā)芽率低的原因是菊芋開發(fā)利用亟待解決的問題。種子生活力的測(cè)定方法較多，常用的簡(jiǎn)單易行的種子生活力測(cè)定方法主要有：發(fā)芽指數(shù)法、活力指數(shù)法、電導(dǎo)率測(cè)定法、四唑染色法等。發(fā)芽指數(shù)法克服了田間氣候復(fù)雜因素的影響，能反映出苗速度和出苗整齊度，但它缺少幼苗生長(zhǎng)趨勢(shì)的反映。活力指數(shù)法在這個(gè)基礎(chǔ)上增加了根、芽的重量或長(zhǎng)度因子，雖然能反映出苗勢(shì)，但它沒有反映種子在不同逆環(huán)境條件下的發(fā)芽情況，且在不同粒度種子之間可比性較小。電導(dǎo)率測(cè)定法可在室內(nèi)同時(shí)測(cè)試大量樣品，但會(huì)因?yàn)榉N子老化或受不良外界條件影響而使細(xì)胞的膜系統(tǒng)發(fā)生變化，導(dǎo)致活力降低，且在種子大粒，小粒以及水分一致性上要求極為嚴(yán)格。趙增煌等［6］報(bào)道以上幾種方法都無法測(cè)定菊芋種子的生活力。四唑染色法是通過鑒定種子內(nèi)部活組織的染色情況，從而對(duì)種子的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)。該方法可快速測(cè)定發(fā)芽緩慢或有休眠種子的生活力，具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)［7］。該研究中，選擇四唑染色法，根據(jù)種子胚部是否染成紅色及染色的部位、形狀和大小，來判斷種子生活力，同時(shí)也為快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行菊芋種子質(zhì)量檢測(cè)和提高菊芋種子發(fā)芽率提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該試驗(yàn)使用的種子采集于甘肅省蘭州市蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)田，該地區(qū)屬溫帶大陸性氣候，冬季寒冷，夏季酷熱，年平均降水量360 mm，年平均氣溫10℃，全年日照時(shí)數(shù)平均2 446 h，無霜期180 d以上。采集的菊芋種子經(jīng)測(cè)定千粒重為6.333 g，風(fēng)干后裝進(jìn)布袋，置于室溫儲(chǔ)藏。

1.2 染色方法

1.2.1種子的預(yù)處理：取顆粒飽滿、發(fā)育成熟的菊芋種子4 000粒，放入燒杯中，并加入蒸餾水，置于25℃培養(yǎng)箱浸種，直至全部種子充分吸脹。浸種結(jié)束，用解剖針小心切開并剝?nèi)シN殼，取出種子。

1.2.2TTC溶液的配制：用pH值6.5～7.5的蒸餾水，分別配制 1.0%、0.5%、0.2%、0.1%的 TTC溶液，貼上濃度標(biāo)簽，避光保存。

1.2.3染色： 分別于 25、30、35、40 、45 ℃溫度下，用濃度為1.0%、0.5%、0.2%、0.1%TTC溶液對(duì)菊芋種子進(jìn)行避光染色，共20個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)，50粒/重復(fù)。每隔1 h觀察1次，并記錄染色完成所需時(shí)間。染色時(shí)間以著色穩(wěn)定為止。

1.2.4判讀：染色結(jié)束后，濾去溶液，用清水沖洗，將種子擺在濕潤(rùn)的濾紙上，根據(jù)種子染色的部位、染色面積的大小和染色程度，逐粒判斷種子的生活力。其中胚根、子葉全部染色的種子記為有生活力的種子；胚根染色、子葉部分染色的種子記為有生活力的種子；胚根染色，子葉沒有染色的種子記為無生活力的種子；胚根未染色、子葉染色的種子記為無生活力的種子；胚根、子葉均不染色者記為無生活力的種子。

表1 不同溫度與TTC濃度下菊芋種子的染色情況及生活力

表2 不同溫度與TTC濃度下菊芋種子的染色情況方差分析結(jié)果

1.2.5生活力的計(jì)算：將經(jīng)判讀有活力的種子數(shù)除以供試種子總數(shù)，即得出種子的生活力。

1.2.6種子發(fā)芽率的測(cè)定：取顆粒飽滿、發(fā)育成熟的菊芋種子400粒，使用2%NaOH溶液浸泡20 min消毒，剝?nèi)テ渲?00粒種子的種殼，分為4組，每組50粒；另外200粒未剝殼種子，分為4組，每組50粒。將分組后的種子放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)皿中放入普通濾紙作為發(fā)芽床，將種子均勻放入，加入適量蒸餾水，使濾紙保持濕潤(rùn)，加蓋，置于25℃培養(yǎng)箱發(fā)芽。以種子著床當(dāng)天為第1天，逐日觀察統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率，直到連續(xù)2 d發(fā)芽種子數(shù)目不再改變?yōu)橹梗陂g注意保持濾紙濕潤(rùn)。種子發(fā)芽率的計(jì)算公式為：

發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和TTC濃度下菊芋種子的染色情況及生活力

不同溫度與TTC濃度下菊芋種子的染色情況及生活力如表1和表2所示。同一TTC濃度下，25～45℃條件下，隨著溫度增高，菊芋種子的染色數(shù)總體上呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，其中35℃條件下，菊芋種子染色數(shù)最多。在25～45℃溫度范圍內(nèi)，溫度相同時(shí)，菊芋種子的染色數(shù)隨著TTC濃度的增加同樣呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，濃度為0.5%時(shí)，菊芋種子的染色數(shù)最高。染色溫度與濃度的交互條件下，TTC濃度0.5%，染色溫度35℃條件下，菊芋種子染色數(shù)最多。因此，四唑染色法測(cè)定菊芋種子活力的適宜TTC濃度為0.5%，適宜溫度為35℃，在該條件下測(cè)得的菊芋種子生活力為72%。

2.2 不同TTC濃度與溫度下所需染色時(shí)間

不同TTC濃度與溫度下所需染色時(shí)間如圖1所示，TTC濃度越高，染色反應(yīng)速度越快，所需時(shí)間越短；染色溫度越高，染色反應(yīng)的速度也越快，所需時(shí)間越短。在菊芋種子染色數(shù)最多的TTC濃度和染色溫度下其染色時(shí)間為7 h。

2.3 菊芋種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果

菊芋種子發(fā)芽率測(cè)定結(jié)果如表3，未剝殼的供試菊芋種子發(fā)芽率為0，而剝殼后菊芋種子的發(fā)芽率為35%。

表3 菊芋種子發(fā)芽率

圖1 不同TTC濃度和溫度下菊芋種子所需染色時(shí)間

3 討論

四唑染色法測(cè)定種子活力原理可靠、方法簡(jiǎn)便、省時(shí)快速，可較準(zhǔn)確地檢測(cè)菊芋種子生活力水平的高低，估計(jì)種子的潛在發(fā)芽能力，但在染色時(shí)需嚴(yán)格掌握TTC溶液濃度和染色溫度。按照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》［7］的規(guī)定，種子四唑染色法濃度不宜超過1.0%，因此1.0%可作為TTC溶液濃度的上限，TTC溶液濃度越高，染色溫度越高，染色時(shí)間越短，因此在染色過程中控制好適宜的染色時(shí)間十分重要，否則所染顏色的不理想，會(huì)給鑒定帶來困難，影響測(cè)定結(jié)果。

研究表明［8］，四唑染色法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率一般很接近，四唑染色法是最有希望代替發(fā)芽試驗(yàn)的方法。在該試驗(yàn)中，剝殼后種子的發(fā)芽率與菊芋種子的生活力測(cè)定結(jié)果并不完全一致，結(jié)果與在玉米等其他種子上的研究結(jié)果相似［9-10］。因此，該試驗(yàn)中四唑染色法測(cè)定的生活力只能用于估測(cè)種子潛在發(fā)芽能力，還不能完全取代發(fā)芽試驗(yàn)。試驗(yàn)中未剝殼種子能吸脹但不能發(fā)芽，而種子剝殼后可以發(fā)芽，這表明菊芋種子的休眠不是由于種殼的不透水而引起的物理休眠，而是種殼上存在某種影響休眠的物質(zhì)導(dǎo)致菊芋種子的休眠。然而該試驗(yàn)研究有限，因此菊芋種子的休眠機(jī)制及破除其種子休眠的方法有待于進(jìn)一步研究。