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    雌激素抑制脂滴包被蛋白Perilipin 2減少肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積

    2018-11-01 09:11:20李鳳娟魏蘇寧王綠婭徐國恒
    心肺血管病雜志 2018年7期
    關(guān)鍵詞:油酸變性脂肪肝

    李鳳娟 魏蘇寧 王綠婭 徐國恒

    非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)目前已成為我國慢性肝病的重要病因[1-2]。當(dāng)女性絕經(jīng)后,脂肪肝的發(fā)病率增高[1-2]。流行病學(xué)、臨床和動物實(shí)驗(yàn)研究均揭示雌激素具有抵抗脂肪肝發(fā)生的作用。脂肪肝病理變化是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脂滴 (lipid droplet)形成和儲積,近年來研究發(fā)現(xiàn),脂滴包被蛋白Perilipin 2 (Plin2) 可以促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累,在肝臟脂質(zhì)代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。而雌激素是否通過影響Plin2而抑制脂肪肝發(fā)生尚未見報道。本文通過建立油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型,研究雌激素對脂滴包被蛋白Plin2的作用,旨在為為圍絕經(jīng)期女性非酒精性脂肪肝防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材料與方法

    1.細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株購自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

    2.主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶購自廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司;油酸購自德國 Calbiochem 公司;尼羅紅染料購自美國Sigma公司;羊抗鼠 Plin 2 抗體由美國國立衛(wèi)生研究院Constantine Londos 教授惠贈;兔抗 EIF5 抗體購自美國Santa Cruz公司。白蛋白結(jié)合的油酸制備:將2.8g不含脂肪酸的BSA溶于20 mL 100mmol/LTris-Cl(pH 8.0)中,向上述溶液中加入78 μL,37 ℃預(yù)熱的油酸液體;溶解后將其過濾除菌得到澄清的油酸儲存液(12.5 mmol/L);油酸儲存液按1:31(v/v)用培養(yǎng)基稀釋即得到0.4 mmol/L油酸誘導(dǎo)工作液,可直接用來刺激細(xì)胞內(nèi)TG蓄積。

    3.油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型建立 HepG2 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。將 1cm x 1cm 的玻片放入 24 孔培養(yǎng)板,取對數(shù)生長期的 HepG2 細(xì)胞種植于 24 孔培養(yǎng)板,制作細(xì)胞爬片。細(xì)胞種植 24 h 后,加入終濃度為 0.4mmol/L油酸誘導(dǎo)工作液培養(yǎng) 48 h,誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性,尼羅紅染色法進(jìn)行染色[5],鏡下觀察拍照(Eclipse 50i 型顯微鏡,日本 Nikon 公司)。

    4.雌激素對肝細(xì)胞脂肪變性的影響 按上訴 “3”方法建立肝細(xì)胞脂肪變性模型,設(shè)置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+不同濃度雌激素(1 nmol、10 nmol、100 nmol 和 1 μmol)的實(shí)驗(yàn)組,處理 48 h,尼羅紅染色法進(jìn)行染色,鏡下觀察拍照。

    5.Plin2 免疫熒光染色 建立肝細(xì)胞脂肪變性模型,設(shè)置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實(shí)驗(yàn)組,處理 48 h 后,進(jìn)行 Plin2 免疫熒光染色,PBS 洗滌細(xì)胞 2 次,4%多聚甲醛室溫固定15min;PBS洗滌3次,加入透膜液(10% Triton X-100)室溫孵育10 min;PBS洗兩次后,加入封閉液封閉10 min;PBS洗1次,加入一抗稀釋液,4 ℃孵育16~18 min;PBS洗3次,二抗稀釋液孵育,室溫避光輕搖 1 h;移去二抗稀釋液,加入Hoechst染液復(fù)染核,室溫孵育10 min;PBS輕柔流洗3次,抗熒光淬滅封片劑封片,鏡下觀察拍照。

    6.蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 建立肝細(xì)胞脂肪變性模型,設(shè)置DMSO對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實(shí)驗(yàn)組,處理48 h后,PBS洗滌細(xì)胞2次。加入適量細(xì)胞裂解液,轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管置冰上,反復(fù)劇烈振蕩解裂解細(xì)胞,BCA法測定蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用5%牛奶封閉液封閉30 min,加入一抗 Plin2(1∶1 000)和EIF5 單抗(1∶10 000),4℃ 孵育過夜(EIF5 單抗室溫孵育60 min),TBST緩沖液(0.05% Tween20 的 TBS 緩沖液)洗膜10 min ×3次,1∶5 000 稀釋 HRP 標(biāo)記的二抗,室溫孵育 60 min,TBST緩沖液洗膜10 min ×3次,膠片發(fā)光,掃描分析。

    7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用多法重復(fù)方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型建立 HepG2 細(xì)胞經(jīng)過油酸誘導(dǎo)后能夠很好的呈現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的特征。細(xì)胞內(nèi)的脂滴主要分布在細(xì)胞質(zhì)靠近細(xì)胞膜的部位。尼羅紅染色可見脂滴呈高亮的橘紅色點(diǎn)狀或片狀分布,而不經(jīng)油酸誘導(dǎo)的DMSO對照則不能生成任何脂滴,說明油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。見圖1。

    圖1 油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性的模型建立(×400) DMSO: 二甲基 亞砜; OA: 油酸(0.4 mmol)

    2.雌激素減少油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性 成功建立油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型后,在加入油酸的同時加入不同濃度的雌激素,觀察雌激素對肝細(xì)胞脂肪變性的影響。結(jié)果顯示雌激素能夠濃度依賴性的降低肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪變性,脂滴的數(shù)量逐漸減少,甚至消失。當(dāng)雌激素濃度為1 μmol 時,抑制效果最為顯著。見圖2。

    3.免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達(dá)的影響 利用已建立的油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型,在加入油酸的同時加入1 μm的雌激素,通過免疫熒光染色觀察雌激素對Plin2蛋白表達(dá)的影響。染色結(jié)果顯示,油酸處理能夠顯著性的增加Plin2的蛋白表達(dá),綠色熒光信號增強(qiáng),當(dāng)加入雌激素后,能夠降低Plin2的蛋白表達(dá)水平,綠色熒光信號明顯減弱。見圖3。

    圖2 雌激素減少油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性(尼羅紅染色,×400倍) 注:DMSO:對照組、油酸模型組(OA:0.4mmol/L)、油酸+不同濃度雌激素(E2) 1 nm、10 nm、100 nm 和 1 μm 的實(shí)驗(yàn)組。

    4.蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步明確雌激素對Plin2蛋白表達(dá)的影響,分別收取了DMSO對照組、油酸模型組和油酸加1 μm雌激素實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞,進(jìn)行了蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示Plin2的蛋白表達(dá)水平在油酸的誘導(dǎo)下顯著升高,加入雌激素后能夠抑制油酸誘導(dǎo)的Plin2的增加。DMSO對照組、油酸誘導(dǎo)模型組和雌激素實(shí)驗(yàn)組Plin2蛋白表達(dá)相對光密度分別為0.409 ± 0.051、0.739 ± 0.060和0.438 ± 0.061,雌激素顯著性減少了油酸誘導(dǎo)的Plin2的蛋白表達(dá)水平(P<0.05,圖4)。

    討 論

    脂肪肝已經(jīng)成為引起慢性肝病和心血管相關(guān)疾病的重要因素之一[6]。正常情況下肝臟內(nèi)脂肪酸的獲取和輸出處于平衡狀態(tài),當(dāng)肝臟脂肪酸獲取增多而輸出受阻時便會引起脂肪肝[7]。目前有關(guān)雌激素抑制脂肪肝發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在影響脂質(zhì)合成和輸出兩個方面。

    女性絕經(jīng)后,卵巢停止產(chǎn)生雌激素,雌激素水平顯著降低,發(fā)生高血脂、胰島素抵抗、脂肪肝等癥狀[8-9]。絕經(jīng)后女性患脂肪肝的概率增加,是絕經(jīng)前女性的兩倍,給予絕經(jīng)后女性進(jìn)行雌激素替代治療后,其發(fā)生脂肪肝的概率明顯下降[10]。Lin 等發(fā)現(xiàn),小鼠卵巢切除后脂質(zhì)從頭合成的關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的表達(dá)明顯增加,肝臟內(nèi)TG含量上升,而給予雌激素后ACC的表達(dá)下降,TG水平也降低,減少了脂肪肝的發(fā)生[11]。雌激素也可通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子PPARδ及其下游靶基因,促進(jìn)脂肪酸的氧化,減少肝臟中脂質(zhì)的積累[12]。由此可見,雌激素可以通過抑制脂質(zhì)合成途徑或是促進(jìn)脂質(zhì)輸出途徑來減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)的含量。

    圖3 免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達(dá)的影響 注:DMSO:對照組、油酸模型組(OA:0.4mmol/L)、油酸+雌激素(E2)1 μm 的實(shí)驗(yàn)組,Plin2 免疫熒 光染色(綠色熒光信號),分別為(×200)和(×400)

    圖4 蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達(dá)的影響 注:A:蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測在DMSO對照組、 油酸模型組和油酸+雌激素實(shí)驗(yàn)組Plin2蛋白表達(dá)水平。B:Plin2相對于EIF5的光密度,注:* P<0.05

    脂肪肝最基本的病理變化是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成和儲積。近年來,脂滴包被蛋白(Perilipin)家族相繼被發(fā)現(xiàn),它們在脂肪代謝過程中發(fā)揮重要作用,其中Plin2廣泛表達(dá)于各種組織。已有文獻(xiàn)報道Plin2可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。外源性過表達(dá)Plin2可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成和積累[13];在肝臟細(xì)胞中過表達(dá)Plin2,TG含量也增多[14]。此外,Plin2基因敲除小鼠與正常小鼠相比,高脂飲食后,肝臟TG的水平下降約60%,并且能夠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝產(chǎn)生[15]。而本研究則發(fā)現(xiàn)雌激素能夠降低Plin2的蛋白表達(dá)水平,減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。

    綜上所述,本文成功建立油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的模型,發(fā)現(xiàn)雌激素可能通過抑制Plin2的蛋白表達(dá)從而減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。本文為圍絕經(jīng)期女性非酒精性脂肪肝防治的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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