胡蒙亮 高豐衣 任航江 韓亭亭 滿 永 李國平 黎 健
隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和現(xiàn)代生活方式與飲食習(xí)慣的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已經(jīng)成為影響發(fā)達(dá)國家三分之一成年人和越來越多兒童的重要代謝性疾病[1],在中國人群中NAFLD也已經(jīng)成為重要的公共健康問題之一[2]。最近的研究表明,I型11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type,11β-HSD1)與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān),在 NAFLD 的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[3]。在成年哺乳動(dòng)物中,11β-HSD1廣泛分布于肝臟、脂肪、性腺和腦中,通過活化局部組織中的糖皮質(zhì)激素水平在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用[4],但對其在脂代謝作用方面的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本研究通過肝臟過表達(dá)11β-HSD1,探究其對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及調(diào)控機(jī)制。
表1 檢測基因的引物
注:SREBP1c:固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c;ACC1:乙酰輔酶A羧化酶;FAS:脂肪酸合成酶;SCD1:硬脂酰輔酶A去飽和酶
1.材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系為C57BL/6遺傳背景雄性小鼠,12周齡,普通飲食,動(dòng)物飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司;蛋白激酶B(AKT)抗體、糖原合酶激酶-3β(GSK)抗體、磷酸化蛋白激酶B(Phospho-AKT, Ser473)抗體、磷酸化糖原合酶激酶-3β(Phospho-GSK-3β, Ser9)抗體、脂肪酸合成酶(FAS)抗體、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)、抗體乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)抗體購自美國CST公司;11β-HSD1抗體購自美國R&D公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG相關(guān)抗原抗體、HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG相關(guān)抗原抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自北京中杉金橋生物公司;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)抗體購自美國Santa Cruz公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo公司。
1.方法 (1) 腺病毒的擴(kuò)增與純化 在293A細(xì)胞中擴(kuò)增腺病毒Ad-GFP和Ad-11β-HSD1,用試劑盒(Vivapure Adeno PACK 100 kit, Vivascience)純化,測定OD值,凍存于-80℃。小鼠尾靜脈注射腺病毒Ad- GFP和Ad-11β-HSD1,劑量為每只小鼠5.0×1010病毒顆粒。
(2)動(dòng)物模型的建立 取20只C57BL/6小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組,每組10只,其中對照組尾靜脈注射腺病毒Ad-GFP,另一實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1,注射后每天觀察小鼠的生活狀態(tài)。小鼠注射腺病毒后,耐受性良好,飲食正常。
(3)肝臟組織脂質(zhì)含量的測定 腺病毒感染小鼠兩周后,禁食4h后稱量小鼠體質(zhì)量,并進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血,離心收集血漿。采血后進(jìn)行麻醉處死,收集肝臟組織后稱重,并凍于液氮備用。切取肝臟組織100mg左右,根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行肝臟脂質(zhì)內(nèi)容物提取,酶法測定TC和TG含量。
(4)肝臟組織冰凍切片油紅O染色 取小塊肝臟組織,OCT包埋,切為8~10μm厚冰凍切片并貼片于潔凈載玻片。10%甲醛固定15min,PBS洗1min,60%異丙醇浸洗數(shù)秒,取出切片并完全干燥后油紅O工作液室溫染色30min,60%異丙醇分化數(shù)秒,PBS洗3次,蘇木素復(fù)染核8s,流水沖洗返藍(lán),甘油封片后鏡檢,照相。
(5)脂代謝相關(guān)蛋白和胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的免疫印跡法分析 凍存的組織標(biāo)本采用RIPA蛋白質(zhì)提取緩沖液提取總蛋白, BCA法測定蛋白濃度。每個(gè)樣品取20μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF膜濕轉(zhuǎn)3h,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,相應(yīng)一抗于4℃搖床孵育過夜,TBST洗膜3次,每次10min。相應(yīng)二抗室溫孵育3h,洗膜3次,每次10min,用化學(xué)發(fā)光液顯影,并用凝膠成像儀照相,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。
圖1 肝臟過表達(dá)11β-HSD1小鼠表型A:小鼠肝臟組織11β-HSD1蛋白表達(dá)水平;B: Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖;C:小鼠體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖;D:小鼠肝臟質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖;E:小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量百分比統(tǒng)計(jì)圖。注:與對照組比較,n=10,*P<0.05,**P<0.01
(6)檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 用Trizol提取肝臟組織總RNA,測定濃度及RNA質(zhì)量后,取5μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,將cDNA稀釋20倍后進(jìn)行目的基因的檢測,總反應(yīng)體系為20μL:2×SYBR Green PCR Mix 10μL,上下游引物各2.5μL,模板cDNA 5μL。反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線判斷反應(yīng)的特異性并通過計(jì)算2-△△ct得到目的基因的相對表達(dá)量,引物設(shè)計(jì)見表1。
圖2 肝臟組織脂質(zhì)含量的檢測 A:肝臟組織中脂質(zhì)油紅O染色結(jié)果;B:肝 臟組織中三酰甘油含量測定結(jié)果。注:與對照組比較,n=10,*P<0.05
1.尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1后,肝臟過表達(dá)該基因并使肝質(zhì)量增大 本實(shí)驗(yàn)通過小鼠尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1,構(gòu)建小鼠非酒精性脂肪肝模型來研究其調(diào)控機(jī)制。腺病毒感染2周后,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,小鼠肝臟成功過表達(dá)11β-HSD1[(1.000±0.053)vs.(1.869±0.125),P<0.01](圖1A~B),但兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,體質(zhì)量分別為(29.56±1.58)g,(29.69±1.20)g(圖1C)。過表達(dá)11β-HSD1后,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝質(zhì)量為(1.44±0.20)g,顯著高于對照組的(1.26±0.16)g,(P<0.05,圖1D)。并且實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝質(zhì)量/體質(zhì)量百分比也顯著高于對照組[(4.3±0.4)vs. (4.9±0.6),P<0.05],圖1E。
2.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,引起肝臟脂質(zhì)蓄積 酶法測定血漿脂質(zhì)含量,結(jié)果顯示兩組小鼠血漿膽固醇和三酰甘油含量并無差異(數(shù)據(jù)未顯示)。肝臟組織冰凍切片油紅O染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,肝臟脂質(zhì)蓄積相對于對照組明顯增多,脂滴變大且分布廣泛(圖2A)。酶法測定肝臟組織脂質(zhì)含量,結(jié)果顯示肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,肝臟脂質(zhì)含量相比對照組增加35.0%[(59.61±3.2)vs. (80.47±5.1),P<0.05],圖2B。這一結(jié)果與油紅O染色結(jié)果相一致,進(jìn)一步證實(shí)肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,可使肝臟脂質(zhì)蓄積。
圖3 肝臟過表達(dá)11β-HSD1后增加脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白 A. Western blot檢測脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白水平; B. Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。注: n=10, *P<0.05
3.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加 提取肝臟組織的總蛋白后,我們首先檢測了長鏈脂肪酸合成途徑中主要的調(diào)控蛋白SREBP1,結(jié)果如圖3A~B顯示,相對于對照組,過表達(dá)11β-HSD1后,SREBP1無論是前體還是成熟肽均顯著增加,其下游調(diào)控蛋白FAS、SCD1也明顯上調(diào),脂肪酸合成通路重要蛋白ACC1表達(dá)顯著升高,這些結(jié)果說明11β-HSD1過表達(dá)后,激活了脂質(zhì)合成通路,這可能是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積的原因之一。
4.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后脂質(zhì)合成相關(guān)基因含量變化 肝臟組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,小鼠肝臟組織脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平并沒有顯著改變(圖4),說明脂質(zhì)合成通路的激活可能發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后水平。
圖5 胰島素信號(hào)通路改變 A. Western blot檢測胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平;B. Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。注:n=10,*P<0.05,**P<0.01
圖4 脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平(n=10)
5.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,降低了AKT、GSK磷酸化水平 本實(shí)驗(yàn)也對兩組小鼠肝臟組織胰島素信號(hào)通路進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示,肝臟過表達(dá)11β-HSD1后,AKT和GSK的磷酸化水平相較于對照組明顯下降,P<0.05(圖5A~B)。上述結(jié)果表明,11β-HSD1過表達(dá)后,影響了胰島素信號(hào)通路,這有可能進(jìn)一步影響了脂代謝。
本實(shí)驗(yàn)通過肝臟過表達(dá)11β-HSD1,研究該基因?qū)χ|(zhì)蓄積的作用及其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示,肝臟脂質(zhì)蓄積而體質(zhì)量并未發(fā)生改變,這與肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,形成輕度脂肪肝,并伴隨胰島素抵抗[3]。然而在該研究中發(fā)現(xiàn),雖然普通飲食能夠最終導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積,但高脂飲食條件下并不能引起該轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的脂質(zhì)增加,機(jī)制目前仍然不清楚[3]。本實(shí)驗(yàn)采用普通飲食喂養(yǎng),長鏈脂肪酸合成通路被激活,脂肪酸合成途徑的主調(diào)控因子SREBP1表達(dá)顯著增加,同時(shí)激活了下游通路FAS、SCD1的表達(dá),脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白ACC1含量也顯著增加。這提供了一個(gè)11β-HSD1過表達(dá)后引起肝臟脂質(zhì)蓄積的解釋。為了進(jìn)一步闡明11β-HSD1如何調(diào)控長鏈脂肪酸的合成途徑,我們也同時(shí)檢測了上述基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,這些基因在mRNA水平?jīng)]有變化,說明11β-HSD1很可能是參與了長鏈脂肪酸合成途徑中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這一結(jié)果得到了11β-HSD1肝臟特異性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[3]和肝臟敲低11β-HSD1的支持[6-7]。
肝臟脂質(zhì)蓄積與胰島素抵抗密切相關(guān)[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫印跡檢測到p-AKT和p-GSK磷酸化水平降低,表明胰島素信號(hào)通路受損,胰島素敏感性降低,其機(jī)制可能是11β-HSD1通過活化區(qū)域性的糖皮質(zhì)激素鈍化了胰島素信號(hào)通路[11-12],從而繼發(fā)地影響脂代謝紊亂。Alberts等[13]研究表明,采用選擇性抑制劑BVT.2733抑制11β-HSD1后,可顯著提高胰島素敏感性,這項(xiàng)研究間接支持了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而最近Stefan等[14]在一個(gè)多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的人群研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)過抑制劑RO509315112的12周治療后,可顯著改善脂肪肝,但并未提高肝臟胰島素敏感性。這些差異可能由遺傳背景或者抑制劑本身的特異性等原因所導(dǎo)致。
本實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射腺病毒感染小鼠,腺病毒本身或可引起炎癥、肝腎毒性等不良反應(yīng),故在后續(xù)的研究中我們將采用肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí),對于脂質(zhì)蓄積我們重點(diǎn)探討了11β-HSD1對脂質(zhì)合成的影響,并未檢測脂質(zhì)吸收、分泌和β-氧化等其它因素,我們將在后續(xù)研究中繼續(xù)探討。此外,本課題組對11β-HSD1的上游調(diào)控因子TNFα的研究結(jié)果表明,TNFα處理HepG2可誘導(dǎo)11β-HSD1表達(dá)升高,進(jìn)一步誘發(fā)胰島素抵抗[15-16],同時(shí)也引起脂質(zhì)蓄積。
本研究推測,11β-HSD1可能通過損傷胰島素信號(hào)通路,并激活脂肪酸合成通路而促進(jìn)小鼠脂肪肝形成。首次闡釋了瞬時(shí)過表達(dá)11β-HSD1可誘發(fā)肝臟脂質(zhì)蓄積,并損害胰島素信號(hào)通路。這為脂肪肝等代謝性疾病的防治提供了新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。