p42/p44促分裂素原活化蛋白激酶上調(diào)炎癥誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1的表達(dá)

張慧娜 李 玉 彭 露 楊云云

沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin 1, SIRT1)在許多生理病理過程如胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調(diào)節(jié)、抵御損傷等方面發(fā)揮重要作用[1]。作為多項生理功能的調(diào)解者， SIRT1的表達(dá)在不同狀態(tài)下也受到精細(xì)調(diào)控，如限制飲食和饑餓狀態(tài)、氧化應(yīng)激及脂肪細(xì)胞的分化均能夠使SIRT1表達(dá)增高[2-4]。SIRT1的抗炎效應(yīng)及其對心血管疾病的保護(hù)作用已有大量報道[5-7]，但炎癥對SIRT1表達(dá)的影響鮮有報道。我們前期發(fā)現(xiàn)NF-κB的大亞基p65參與了TNF-α對SIRT1的表達(dá)上調(diào)[8]。本研究擬檢測球囊損傷的大鼠頸總動脈及TNF-α處理的，大鼠血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)情況及促分裂素原活化蛋白激酶(mifogen-achvated protein kinases,MAPKs)信號通路，尤其是p42/p44 MAPK通路在其中所起的作用，探討了炎癥狀態(tài)對血管平滑肌SIRT1基因的表達(dá)影響及其相關(guān)信號通路。

材料與方法

1.動物及試劑 雄性，SD大鼠，體質(zhì)量300g左右，共12只。由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供；進(jìn)口胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基為HyClone公司產(chǎn)品；TNF-α購自Peprotech公司；PD98095、α-SMA、anti-Actin和anti-α-p42/p44 MAPK及Phospho-anti-α-p42/p44 MAPK抗體購自Sigma Aldrich公司； anti-SIRT1抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購自Santa Cruz公司；ECL試劑盒購自威格拉斯公司；HRP-DAB檢測試劑盒、山羊血清購自北京中杉金橋公司。

2.動物分組及球囊損傷模型 將300g左右雄性，SD大鼠12只，每組4只，分為三組，分別是未作手術(shù)組，假平均組和球聲損傷組，假手術(shù)組進(jìn)行麻醉、固定后鈍性分離左頸總動脈。球囊損傷模型組行麻醉固定后鈍性分離左頸動脈結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)心端，近心端用血管鉗暫時阻斷血流，用顯微外科剪在血管遠(yuǎn)心端1/3處橫向剪一小口，逆行將球囊插入左頸總動脈近心端約2～2.5 cm，用空氣充盈球囊，緩慢來回抽動3次剝脫內(nèi)膜。結(jié)扎左頸總動脈近心端并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，防止黏連。逐層縫合皮下組織與皮膚。術(shù)后注射青霉素20萬單位預(yù)防感染。喂食普通飼料，自由飲水。術(shù)后28d，取損傷部位的左頸總動脈約1.0cm，石蠟包埋后行病理切片，HE染色和免疫組化染色。

3.血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 將2～3只，體質(zhì)量100～150g 麻醉、固定后，75%乙醇消毒，在體分離胸主動脈，去除血凝塊、血管外膜層及脂肪，剪開血管腔，去除血管內(nèi)膜，放入盛有D-Hank’s液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀片將血管切成1mm2的方塊并在2.5%胰酶消化液中消化1min后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶，組織塊的間距為0.5cm，使貼組織塊的瓶底朝上培養(yǎng)4～5h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中(10%胎牛血清的高糖DMEM)，繼續(xù)靜置3～5d，待有細(xì)胞從組織塊周圍游離出后換液。大部分組織塊長出細(xì)胞暈，并與相鄰細(xì)胞暈相接觸時傳代。

4.TNF-α處理大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞 大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞長到約80%滿，加入TNF-α(30ng/mL)刺激，8h后收獲細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，或在收獲細(xì)胞總蛋白之前30min加入p42/p44 MAPK(ERK1/2)抑制劑PD98059 (20 μmol/L)，JNK抑制劑SP600125(10μmol/L)或p38 MAPK抑制劑SB202190(10 μmol/L)，Western blotting檢測SIRT1表達(dá)水平。

5.HE染色 石蠟切片用二甲苯進(jìn)行兩次脫蠟后浸入100%到70%遞減的乙醇溶液中各1min，蒸餾水漂洗一次，蘇木素溶液染色5min，自來沖洗后入稀釋的鹽酸乙醇溶液中分色至核呈紫藍(lán)色，自來水返藍(lán)，蒸餾水洗去堿性水分，70%和80%乙醇各洗5min，入伊紅染液染色30s至數(shù)分鐘，以95%乙醇分色至胞漿、結(jié)締組織呈桃紅色。染色后的切片浸入從70%到100%遞升的乙醇溶液脫水，之后浸入二甲苯5min，將組織周圍多余的二甲苯拭去，滴中性樹膠后加蓋玻片封固。

6.免疫組化 石蠟切片用二甲苯脫行兩次脫蠟后浸入100%到70%遞減的乙醇溶液中各1min，PBS漂洗后浸入3% H2O2室溫孵育5～10min，再一次PBS漂洗后浸入pH 8.0的 EDTA中，高壓鍋121°C 處理10min以修復(fù)抗原，PBS漂洗三次后滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育1～2h，之后進(jìn)行PBS漂洗并滴加相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min。PBS漂洗后用DAB顯色試劑盒顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染核，梯度乙醇脫水，二甲苯處理, 以中性樹脂封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。

7.Western blotting 細(xì)胞加RIPA裂解液裂解，冰浴15～30 min。4℃，12 000 r/min離心15min。上清液即為細(xì)胞總蛋白。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將30μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，4℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗2h，ECL法檢測蛋白表達(dá)。

8.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料間兩組均數(shù)比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 大鼠左頸總動脈球囊損傷導(dǎo)致SIRT1表達(dá)增加 A：SD雄性大鼠左頸總動脈球囊損傷28天后進(jìn)行石蠟切片和HE染色(100×)；B：損傷組和對照組分別用α-SMC actin和anti-SIRT1抗體進(jìn)行免疫組化染色(n=4) (400×)

結(jié) 果

1.球囊損傷的大鼠頸總動脈中SIRT1表達(dá)增加 在SD大鼠左頸總動脈球囊損傷模型中觀察到損傷第28天新生內(nèi)膜層明顯增厚，管腔極度縮窄(圖1A)，用血管平滑肌的標(biāo)志蛋白α-SMA作免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜中有大量的血管平滑肌細(xì)胞(圖1B)。免疫組化的結(jié)果顯示球囊損傷模型組與對照組相比，SIRT1的表達(dá)明顯增高(圖1B)。

2.TNF-α促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá) 以往的研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷的頸總動脈模型中TNF-α等炎癥因子表達(dá)增高[9-10]。為了進(jìn)一步明確炎癥損傷對SIRT1表達(dá)的影響，在細(xì)胞水平，我們檢測了TNF-α處理的原代血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1主要集中表達(dá)于細(xì)胞核，且30ng/mL TNF-α處理8小時后，血管平滑肌細(xì)胞SIRT1的表達(dá)增高(圖2)。

圖2 TNF-α 促進(jìn)血管平滑肌中SIRT1表達(dá) 免疫熒光檢測TNF-α對血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性SIRT1表達(dá)的影響。30ng/mL TNF-α處理原代血管平滑肌細(xì)胞8h后，用SIRT1一抗和FITC(綠色)標(biāo)記的二抗孵育。 DAPI(藍(lán)色)用于細(xì)胞核染色(×20μm)

圖3 p42/p44 MAPK參與血管平滑肌細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的SIRT表達(dá) A：TNF-α促進(jìn)血管平滴滑肌細(xì)胞SIRT1和磷酸化p42/p44 MAPK蛋白表達(dá)；B：PD98059 (20 μM)，JNK抑制劑SP600125(10μM)或p38抑制劑SB202190(10μM)預(yù)處理血管平滑肌細(xì)胞30min TNF-α誘導(dǎo)的SIRT1表達(dá)被MAPK抑制劑逆轉(zhuǎn)(n=4)； 注：與未用TNF-α處理組相比，*P<0.05，與TNF-α處理組相比，#P<0.05

3.p42/p44 MAPK通路參與了TNF-α對SIRT1的表達(dá)調(diào)節(jié) p42/p44 MAPK通路作為TNF-α的重要下游通路，在TNF-α與TNF-α細(xì)胞膜受體結(jié)合后被激活[11]。為了考察p42/p44 MAPK信號通路是否參與了TNF-α對SIRT1表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)，我們首先檢測了TNF-α處理的血管平滑肌細(xì)胞中磷酸化p42/p44 MAPK蛋白的表達(dá)(圖3A)，Western blotting結(jié)果顯示：30 μg/mL TNF-α處理血管平滑肌細(xì)肌8h后，SIRT1表達(dá)增高的同時p42/p44 MAPK磷酸化信號也增強(qiáng)。另一方面，我們用p42/p44 MAPK通路的抑制劑PD98059(20μmol/L)提前處理血管平滑肌細(xì)胞30min，發(fā)現(xiàn)抑制這條通路后TNF-α對SIRT1表達(dá)的誘導(dǎo)作用也被抑制，說明p42/p44 MAPK通路在TNF-α對SIRT1的誘導(dǎo)過程中起重要的作用。同時，我們也觀察到當(dāng)利用JNK抑制BP600125(10μmol/L)或P38抑制劑SB202190(10μmol/L)預(yù)處理血管平滑肌細(xì)胞30min后，再用30μg/L TNF-α處理8h, Westem blotting結(jié)果，顯示TNF-α對SIRT1的誘導(dǎo)效應(yīng)也有不同程度的降低(圖3B)。

討 論

頸總動脈球囊損傷模型是血管炎癥損傷的經(jīng)典模型，血管平滑肌細(xì)胞在炎癥因子的刺激下遷移到內(nèi)膜下層并增殖形成新生內(nèi)膜。TNF-α是參與頸總動脈球囊損傷及冠狀動脈支架植入后再狹窄關(guān)鍵炎癥因子[9,12-13]等等。我們在大鼠頸總動脈球囊損傷模型中觀察到SIRT1表達(dá)增高；細(xì)胞水平實驗結(jié)果提示TNF-α誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞中SIRT1表達(dá)增加。結(jié)合細(xì)胞水平的實驗的結(jié)果，我們至少可以推測TNF-α是造成SIRT1在球囊損傷頸總動脈中表達(dá)增加的原因之一。

Ⅲ類組蛋白去乙?；窼IRT1的抗炎效應(yīng)已有大量報道，主要是通過抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB來抑制TNF-α，IL-6等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，繼而抑制炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展[7,14-15]。而本研究中觀察到在血管平滑肌細(xì)胞中炎癥因子TNF-α增加SIRT1的表達(dá)。SIRT1在血管平滑肌受到不良刺激時表達(dá)增高具有什么樣的生理意義呢？我們推測SIRT1可能在血管平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中起到一個平衡調(diào)節(jié)的作用，即不良因素的刺激一方面促進(jìn)炎性基因TNF-α的表達(dá)，而另一方面增加的炎癥因子TNF-α又可以通過某些機(jī)制促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，SIRT1和TNF-α之間的這種負(fù)反饋效應(yīng)在一定程度上可以抑制由于損傷刺激導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞的過度炎癥反應(yīng)，使得細(xì)胞對損傷刺激的反應(yīng)處于適度的水平。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的大亞基p65參與了TNF-α對SIRT1表達(dá)的上調(diào)作用[8]。本研究中，我們主要關(guān)注MAPKs信號通路對SIRT1表達(dá)的影響。MAPKs信號通路是TNF-α激活的細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括p42/p44 MAPK、P38MAPK、和JNK三條通路。其中，JNK和p38MAPK對SIRT1的正向調(diào)節(jié)已有文獻(xiàn)報道。而p42/p44 MAPK對SIRT的調(diào)節(jié)還未有報道。Nargis Nasrin等發(fā)現(xiàn)JNK可以通過使SIRT1磷酸化來提高其活性[16]；而用p38 MAPK的抑制劑則可以抑制Icariin對SIRT1表達(dá)的誘導(dǎo)作用[17]。與先前的報道一致，本研究中我們發(fā)現(xiàn)JNK和P38 MAPK通路的抑制劑SP600125、SB202190均可以在不同程度上抑制TNF-α誘導(dǎo)的SIRT1的表達(dá)，同時，我們還發(fā)現(xiàn)MAPKs的另一條信號通路p42/p44 MAPK同樣能夠調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)，用p42/p44 MAPK的抑制劑PD98059能夠顯著地抑制TNF-α誘導(dǎo)的SIRT1表達(dá)。在三條MAPKs的通路中，p42/p44 MAPK及JNK的抑制劑PD98059、SP600125對SIRT1的抑制作用較p38的抑制劑SB202190的抑制作用更強(qiáng)(圖3B)，我們推測， p42/p44 MAPK及JNK在TNF-α對SIRT1的誘導(dǎo)中起更重要的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)在球囊損傷的血管平滑肌及TNF-α處理的血管平滑肌中SIRT1表達(dá)增高，且p42/p44 MAPK通路參與了TNF-α對SIRT1的誘導(dǎo)作用。這將對于進(jìn)一步研究SIRT1在炎癥狀態(tài)下的表達(dá)調(diào)控及深入理解SIRT1在炎癥中的作用奠定基礎(chǔ)。