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    利用全外顯子組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)Noonan綜合征BRAF基因新生突變

    2018-11-01 09:11:00郝嬋娟陳臘梅郭若蘭唐浩勛
    心肺血管病雜志 2018年7期
    關(guān)鍵詞:肺動(dòng)脈瓣外顯子變異

    郝嬋娟 陳臘梅 郭 俊 郭若蘭 唐浩勛 李 巍

    Noonan綜合征(Noonan syndrome,NS)是一種常染色體顯性遺傳病,主要臨床表現(xiàn)為先天性心臟病、身材矮小、特殊面容、發(fā)育遲緩、凝血功能障礙、骨骼畸形等,累及多個(gè)系統(tǒng)器官[1-3]。在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率約為1/2 500~1/1 000[3-4]。家族性復(fù)發(fā)符合常染色體顯性遺傳模式,但散發(fā)病例更為常見,約占60%[5]。目前認(rèn)為,NS發(fā)病與絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路(RAS-mitogen-activated protein kinase,RAS-MAPK)的信號異常相關(guān)。隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和運(yùn)用,目前已明確多個(gè)基因與NS及類NS樣疾病相關(guān),包括PTPN11、SOS1、RAF1、BRAF、KRAS、NRAS、SHOC2、CBL、MAP2K1、SOS2、RIT1、RASA2和A2ML1[6-8]等。本研究對1例疑似NS患兒及其父母進(jìn)行全外顯子測序,發(fā)現(xiàn)該患兒存在1個(gè)BRAF基因的新生雜合突變。通過回顧患兒的臨床表型、實(shí)驗(yàn)室檢查,分析突變基因型與臨床表型相關(guān)性,將為NS患兒臨床診斷、治療和遺傳咨詢提供更好的依據(jù)。

    資料與方法

    1.病例選擇 患兒,身高75cm,體質(zhì)量10kg,生長發(fā)育落后(1歲,可獨(dú)坐;3歲,可說單個(gè)詞語;4歲,可扶走,有眼神交流,對答反應(yīng)略緩慢,無智力倒退史,否認(rèn)驚厥史),軀干與四肢皮膚無斑點(diǎn)角化過度,頭發(fā)偏少,略卷曲,但發(fā)質(zhì)正常,無明顯脫落。特殊面容:前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、無外眼角下垂及眼球震顫、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋、小頜畸形、頸短(圖1)。胸廓未見畸形。心前區(qū)無異常隆起,心音有力,律齊,胸骨左緣第二肋間聞及3/6級收縮期雜音。掌跖皮膚大致正常。肌張力基本正常,肌力Ⅴ—級。患兒為第二胎第二產(chǎn),足月順產(chǎn),出生時(shí)體質(zhì)量3.4kg。母孕期常規(guī)檢查,超聲心動(dòng)圖提示:胎兒心胸比增大,心臟增大,室壁增厚,二尖瓣、三尖瓣、靜脈導(dǎo)管頻譜異常,動(dòng)脈導(dǎo)管舒張期血流增快,卵圓孔偏大,偶發(fā)心動(dòng)過緩。出生后3個(gè)月于我院行超聲心動(dòng)圖檢查,確診為輕度肺動(dòng)脈瓣狹窄、卵圓孔未閉。9月齡時(shí)查發(fā)育商低下。1歲6個(gè)月時(shí)于我院行超聲心動(dòng)圖,示中度肺動(dòng)脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉(圖2)。2歲時(shí)于某醫(yī)院完成肺動(dòng)脈瓣狹窄球囊擴(kuò)張術(shù)。2歲時(shí),腸系淋巴結(jié)彩色多普勒超聲檢查腹腔內(nèi)未見明顯腫大淋巴結(jié)。3歲前患兒反復(fù)呼吸道感染。

    2. 實(shí)驗(yàn)室檢查 9個(gè)月齡時(shí)血尿代謝病篩查未見異常,2歲時(shí)于肺動(dòng)脈瓣狹窄球囊擴(kuò)張術(shù)前進(jìn)行血常規(guī)、肝腎功能、出凝血時(shí)間、免疫球蛋白檢查,結(jié)果均正常。氨基酸、肉堿血代謝篩查未發(fā)現(xiàn)特異性脂肪酸代謝異常。血生化檢查示堿性磷酸酶(ALP)偏高(156U/L,正常范圍35~100U/L),肌酐(CREA)偏低(18.3μmol/L,正常范圍45~84 μmol/L)。全血細(xì)胞分析:血小板(PLT)數(shù)量正常,血小板分布寬度(PDW)偏低(7.8%,正常范圍9.9%~16.1%),大血小板比率(P-LCR)偏低(7.8%,正常范圍13%~43%)。

    2017年8月患兒家屬來北京兒童醫(yī)院遺傳咨詢門診進(jìn)行遺傳咨詢。父母非近親結(jié)婚,家族中無類似患兒。本研究得到北京市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并經(jīng)患兒及其家屬知情同意,簽訂知情同意書。

    圖1 患兒主要臨床特征 A~B:正面圖,C~D:側(cè)面圖

    圖2 患兒超聲心動(dòng)圖 圖示中度肺動(dòng)脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉。房間隔卵圓窩處回聲中斷約2.6mm。肺動(dòng)脈瓣為三葉瓣,瓣膜回聲稍粗厚,活動(dòng)尚可, 瓣環(huán)徑約11.6mm,瓣口徑約8.3mm

    3.基因組DNA的提?。喝』純杭捌涓改竿庵莒o脈血2mL(EDTA抗凝),用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。

    4.全外顯子測序:將基因組DNA打斷成隨機(jī)片段,經(jīng)純化后使用Agilent SureSelect Human All Exome V6試劑盒(加拿大Agilent Technologies公司)進(jìn)行全基因組外顯子捕獲,捕獲后的片段經(jīng)過富集度質(zhì)控后進(jìn)行測序文庫制備,利用Illumina Hiseq X Ten測序儀(美國Illumina公司)進(jìn)行雙端高通量測序,讀長為150bp,測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過基本數(shù)據(jù)分析(Base calling、過濾接頭序列、去污染),運(yùn)用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件[9]比對到GRCh37/hg19參考基因組上,識(shí)別樣本的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失突變(InDels)并對其所在基因進(jìn)行注釋,同時(shí)進(jìn)行測序深度、覆蓋度及均一性等有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

    5.生物信息學(xué)分析:利用dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組、ExAC數(shù)據(jù)庫分析變異頻率,濾掉次等位基因頻率>0.005的普遍變異。利用五種預(yù)測軟件SIFT(http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html)、Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org)、Mutation Assessor(http://mutationassessor.org/)和CADD(http://cadd.gs.washington.edu/)對變異位點(diǎn)進(jìn)行有害性分析,以鑒定變異對蛋白質(zhì)功能的潛在影響。同時(shí)篩查變異位點(diǎn)是否被三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(ClinVar、OMIM、HGMD)收錄為有害變異。此外,利用UCSC(http://genome.ucsc.edu)進(jìn)行BRAF新發(fā)突變位點(diǎn)同源序列保守性分析,利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/protein/P15056)進(jìn)行BRAF新發(fā)突變位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域分析。利用美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)分級標(biāo)準(zhǔn)對變異進(jìn)行分級[10]。

    6.Sanger測序驗(yàn)證:根據(jù)需要測序的DNA片段合成引物,對患兒及其父母DNA用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增,用ABI 3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以Sanger測序法進(jìn)行測序,測序結(jié)果與全外顯子測序后的結(jié)果進(jìn)行比對。

    結(jié) 果

    圖3 患兒及其父母基因檢測結(jié)果 在患兒BRAF基因中找到新生雜合錯(cuò)義突變c.770A>G(p.Q257R)(紅色箭頭),其父母均無此變異(綠 色箭頭)

    1. 基因檢測結(jié)果:通過生物信息學(xué)分析,在患兒BRAF基因中找到一個(gè)雜合錯(cuò)義突變c.770A>G(p.Q257R),導(dǎo)致該蛋白第257位的谷氨酰胺改變?yōu)榫彼?,其父母此位點(diǎn)為正?;蛐停撟儺悶榛純骸靶掳l(fā)突變”。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger 測序,測序結(jié)果與全外顯子測序結(jié)果相同(圖3)。該患兒有一位7歲的哥哥, 生長發(fā)育無異常,未做基因檢測。BRAF突變可導(dǎo)致心面皮膚綜合征(cardio-facio-cutaneous,CFCS)和NS。c.770A>G(p.Q257R)在三個(gè)SNP數(shù)據(jù)庫(dbSNP,千人基因組和ExAC)中未發(fā)現(xiàn)變異頻率,dbSNP報(bào)告的SNP號為rs180177035(表1)。HGMD、ClinVar和OMIM三個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫收錄該變異為致病變異。五種預(yù)測軟件SIFT、Mutation Taster、Polyphen-2、Mutation Assessor、CADD預(yù)測該變異對蛋白質(zhì)功能是有害或可能有害的(表2)。BRAF新發(fā)突變位點(diǎn)位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖4),在不同物種間具有同源序列,且具有高度保守性(圖5)。根據(jù)ACMG分級標(biāo)準(zhǔn),我們將BRAF c.770A>G分級為致病變異。

    2. 患兒的臨床特征符合NS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11],結(jié)合基因檢測結(jié)果,診斷為NS。

    圖4 BRAF c.770A>G(p.Q257R)位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域

    圖5 BRAF c.770A>G(p.Q257R)在不同物種間具有同源序列,且具有高度保守性

    基因轉(zhuǎn)錄本cDNA蛋白雜合性ExAC千人基因組dbSNPBRAFNM_004333c.770A>Gp.Q257R雜合子--rs180177035

    表2 患兒BRAF c.770A>G致病性預(yù)測

    討 論

    通過對患兒及父母進(jìn)行全外顯子測序,我們發(fā)現(xiàn)患兒在BRAF基因存在一個(gè)新發(fā)錯(cuò)義突變c.770A>G(p.Q257R)。BRAF含18個(gè)外顯子,位于染色體7q34,編碼參與MAPK/ERK信號傳導(dǎo)途徑的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是RAS的效應(yīng)物和MAPK組件的上游組分,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、增殖、衰老和凋亡,在癌癥和發(fā)育綜合征中發(fā)揮重要作用[12-15]。

    BRAF是CFCS的主要致病基因(約占50%~75%),而在NS病例中極少見(<2%)[16]。與CFCS相關(guān)的BRAF突變大部分發(fā)生在外顯子6和外顯子12上。錯(cuò)義突變c.770A>G(p.Q257R)是發(fā)生在外顯子6的最常見的突變(發(fā)生率為29%)[12]。BRAF c.770A>G位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域,多種預(yù)測軟件預(yù)測該變異對蛋白質(zhì)功能是有害或可能有害,在不同物種間具有同源序列,且具有高度保守性。Tetsuya 等的研究表明c.770A>G(p.Q257R)突變顯著激活ELK依賴性轉(zhuǎn)錄,有助于BRAF的激活,刺激RAS-ERK途徑[14],最終ERK信號分子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并對刺激信號作出反應(yīng)。根據(jù)ACMG分級標(biāo)準(zhǔn),BRAF c.770A>G分級為致病變異。

    大部分報(bào)道表明BRAF c.770A>G突變引起CFCS[12, 14, 17],但是也有這個(gè)突變位點(diǎn)引起NS的報(bào)道[18]。CFCS與NS均為RAS-MAPK信號通路異常導(dǎo)致的疾病,故二者具有相似的臨床特征。

    NS主要臨床特征包括身材矮小、特殊面容、先天性心臟病、發(fā)育遲緩、出血傾向、胸骨畸形、淋巴系統(tǒng)發(fā)育不良等,可累及多個(gè)系統(tǒng)器官。特殊面容包括前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋和增厚、頭發(fā)卷曲、后發(fā)際線低等,心臟病變最常見的是肺動(dòng)脈狹窄(通常伴有異常增生的瓣膜,50%~60%)、肥厚型心肌病(20%)和繼發(fā)性房間隔缺損(6%~10%)[1- 2, 4, 19- 20]。

    CFCS絕大多數(shù)病例由BRAF、MEK1、MEK2基因突變引起,常見的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟病、皮膚異常、生長發(fā)育遲緩、胃腸功能紊亂、神經(jīng)認(rèn)知延遲和癲癇發(fā)作[21]。

    CFCS與NS的區(qū)別在于存在外胚層發(fā)育異常和更嚴(yán)重的智力障礙[22]。與NS患者相比,CFCS患者的面部更寬、呈現(xiàn)大頭畸形、毛發(fā)生長緩慢,睫毛和眉毛稀疏或缺失、毛囊角化和掌跖角化過度、肌張力低下及更嚴(yán)重的發(fā)育遲緩和嬰兒期喂養(yǎng)問題[23-24]。為明確診斷,我們進(jìn)一步比較了本例患兒的臨床表型與CFCS和NS的異同。本例患兒臨床表現(xiàn)為生長發(fā)育落后、特殊面容,超聲檢查示肺動(dòng)脈瓣及瓣下流出道狹窄,卵圓孔未閉。此患兒雖有生長發(fā)育落后,但程度較輕,與醫(yī)生有眼神交流,對答正確,僅略顯緩慢。神經(jīng)系統(tǒng)檢查,肌張力基本正常,肌力稍低。本例患兒的臨床表型符合NS,BRAF c.770A>G為疾病的致病變異。中國人群中的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)已報(bào)道4例基因診斷明確的NS患兒存在BRAF基因的新發(fā)雜合錯(cuò)義突變[18],其中有1例的突變位點(diǎn)與本例相同,臨床表型與本例患者基本相同,但出現(xiàn)喂養(yǎng)困難及胸部畸形,先天性心臟異常則表現(xiàn)為房間隔缺損。

    NS的遺傳異質(zhì)性強(qiáng),同一基因突變可有不同的臨床表現(xiàn),甚至同一基因同一位點(diǎn)突變,臨床亦可表現(xiàn)明顯差異,所以僅通過臨床表型很難進(jìn)行臨床診斷,而應(yīng)結(jié)合分子遺傳學(xué)分析,從基因水平幫助臨床進(jìn)行精確診斷。傳統(tǒng)的Sanger測序法測序通量較低,難以滿足NS基因診斷需求,需要高通量的方法來進(jìn)行致病基因的檢測。近年來,隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)分析手段的豐富,全外顯子測序,作為一種快速而經(jīng)濟(jì)的技術(shù),已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷[25-28],其不僅使患兒在短時(shí)間內(nèi)得到確診,還為理解疾病發(fā)病機(jī)制提供線索,從而引導(dǎo)臨床醫(yī)生尋求更可靠的遺傳咨詢以及更有針對性的臨床干預(yù)和治療。

    NS缺乏特異性治療方案,目前仍以對癥治療為主,建議多學(xué)科聯(lián)合隨訪。典型的面部特征會(huì)隨年齡的增長而逐漸改變。先天性心臟異常如肺動(dòng)脈瓣狹窄,可根據(jù)狹窄程度,選擇定期隨訪、介入治療或外科手術(shù)。本例患兒則采用肺動(dòng)脈瓣狹窄球囊擴(kuò)張術(shù)進(jìn)行治療。在2007年,美國食品藥品監(jiān)督局推薦伴有身材矮小的NS患兒可給予重組人生長激素(rhGH)治療。目前,國內(nèi)也推薦rhGH用于治療伴有身材矮小的NS患兒[29]。與此同時(shí),預(yù)防干預(yù)亦不容忽視,產(chǎn)前基因診斷有助于預(yù)防患兒出生,也是目前主要的干預(yù)措施?;蛟\斷不僅可以評估患兒的預(yù)后,還可為相關(guān)家庭再次生育提供產(chǎn)前咨詢和產(chǎn)前診斷的依據(jù),以期真正達(dá)到預(yù)防和降低NS發(fā)生率的目的。

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