DON暴露對(duì)斷奶仔豬抗氧化水平、血清生化指標(biāo)及小腸黏膜形態(tài)的影響

王希春，張婭菲，儲(chǔ)小燕，朱 雷，朱電鋒，馮士彬，李 玉，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱為嘔吐毒素，是一種主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的B型單端孢霉烯族毒素[1]，是世界上最常見(jiàn)的霉菌毒素之一。近年來(lái)，DON在糧食作物中污染的問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮，Wu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)不同省的飼料原料和全價(jià)飼料中的DON檢出率為93.9%。對(duì)2017年上半年全國(guó)飼料霉菌毒素檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，DON的檢出率為98.3%，平均含量為1 855.2 μg·kg-1，超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的最高限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。動(dòng)物采食DON污染的飼糧后，出現(xiàn)厭食、嘔吐、發(fā)熱、反應(yīng)遲鈍等中毒癥狀，消化系統(tǒng)受到一定程度的損傷，并產(chǎn)生氧化應(yīng)激[4]。在畜禽中，豬對(duì)DON的敏感性最強(qiáng)[5]。研究表明，高劑量DON可降低斷奶仔豬脾臟中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性，并顯著提高丙二醛(MDA)的含量[6]。在DON與玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)的聯(lián)合作用下，可使仔豬血清中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量增加72.0%、32.6%和36.6%[7]。此外，DON還是蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑，其主要靶細(xì)胞為腸上皮細(xì)胞[8]，無(wú)論是低劑量還是高劑量的DON暴露均可導(dǎo)致不同程度的腸道損傷。目前，飼料中DON對(duì)仔豬抗氧化作用及機(jī)體生理生化、消化系統(tǒng)毒性的研究尚不完善。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)斷奶仔豬飼喂DON污染飼料，研究其對(duì)仔豬機(jī)體抗氧化指標(biāo)、血清生化指標(biāo)及腸道黏膜屏障的影響，為豐富和完善DON的毒性作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用 “杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬，由安徽省青陽(yáng)縣五星畜牧種豬場(chǎng)提供。

1.2 試劑和儀器

禾谷鐮刀菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中毒病實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；玉米購(gòu)自合肥市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；離心管、TIP頭，美國(guó)Axygen Biosciences公司；BSD-100振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；TGL-18R臺(tái)式高速離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；BS-220全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司；YD-1508R 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；CX31光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；ELISA試劑盒，南京森貝迦生物技術(shù)有限公司。

1.3 DON飼糧的制備

將保存于4 ℃的禾谷鐮刀菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)情況。將復(fù)蘇好的禾谷鐮刀菌接種到察氏液體培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，120 r·min-125℃培養(yǎng)5～7 d。隨后將150 g干燥玉米裝入500 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)水分含量至45%，塞上軟膠塞，置于同一培養(yǎng)箱中，27 ℃培養(yǎng)20 d，取出錐形瓶，滅菌后烘干備用。將烘干的霉變玉米粉碎，使用液相色譜法，測(cè)定其中DON含量，然后與基礎(chǔ)飼糧(DON、ZEN含量分別為0.15、0.05 mg·kg-1)進(jìn)行混合，分別制備含量為1 mg·kg-1與2 mg·kg-1的DON飼糧。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)管理

選取30頭21日齡斷奶仔豬(平均體質(zhì)量為6.87±0.41 kg)，隨機(jī)分為3欄，每欄10頭，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)、低劑量DON飼糧(DON含量為1 mg·kg-1)、高劑量DON飼糧(DON含量為2 mg·kg-1)，試驗(yàn)期為60 d。自由采食，自由飲水，每天觀察仔豬的采食和健康狀況，消毒免疫程序嚴(yán)格按照豬場(chǎng)管理方案進(jìn)行。

1.5 檢測(cè)樣本的制備

1.5.1 血清的制備

在60 d時(shí)，對(duì)所有仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，血液樣品靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min，制備血清，-20 ℃保存，用于測(cè)定相關(guān)血清指標(biāo)。

1.5.2 小腸病理切片制作

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選擇5頭仔豬放血致死，采集十二指腸、空腸中段、回腸中段各5 cm，置于10%甲醛溶液中固定。48～72 h 后取出固定的腸道樣本，進(jìn)行石蠟包埋，切取5 μm切片并進(jìn)行HE染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.6.1 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

使用深圳邁瑞公司BS-220全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清生化指標(biāo)測(cè)定。檢測(cè)指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、淀粉酶(α-AMY)、脂肪酶(LIP)、鈣(Ca)、磷(P)、肌酸激酶(CK)。所有指標(biāo)的測(cè)定操作均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.2 抗氧化性能指標(biāo)的測(cè)定

分別用豬SOD、GSH-Px、CAT、NO、MDA ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.3 腸道通透性指標(biāo)的測(cè)定

分別用豬DAO及D-乳酸(D-LA)ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.4 小腸絨毛高度及隱窩深度的測(cè)量

小腸組織HE染色切片在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，分別選取10個(gè)典型視野(絨毛結(jié)構(gòu)完整、走向平直)，使用ISCapture V3.5數(shù)碼互動(dòng)成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，在Image-Pro Plus 6.0軟件中測(cè)量各視野中絨毛高度及隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DON對(duì)斷奶仔豬抗氧化性能的影響

由表1可知，高劑量組血清中SOD、GSH-Px、CAT含量顯著低于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)；低劑量組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。高劑量組血清中NO含量較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。此外，高劑量組血清中MDA顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 DON對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，高劑量組血清中AST含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，ALP含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，γ-GGT顯著高于對(duì)照組與低劑量組(P<0.05)。高劑量組血清CREA顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)，低劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。高劑量組與低劑量組α-AMY含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。高劑量組LIP顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CK顯著高于低劑量組與對(duì)照組(P<0.05)。

表1DON對(duì)斷奶仔豬抗氧化性能的影響

Table1Effect of DON on antioxidant capacity in weanling piglets

指標(biāo)Indexes對(duì)照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group超氧化物歧化酶SOD/(ng·L-1)80.61±2.31 a70.79±3.30 b61.65±3.59 c谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶GSH-Px/(ng·L-1)357.04±5.74 a340.86±5.59 b325.87±5.21 c過(guò)氧化氫酶CAT/(ng·L-1)28.89±1.45 a25.87±2.09 b19.43±1.26 c一氧化氮NO/(μmol·L-1)31.00±2.32 b31.24±1.07 ab34.13±4.90 a丙二醛MDA/(nmol·L-1)14.51±0.70 c17.56±1.33 b21.16±1.25 a

同行比較，無(wú)相同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters wihin the same row indicated significant difference atP<0.05 . The same as follows.

2.3 DON對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響

由表3可見(jiàn)：試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組間血清中DAO與D-LA含量無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)束后，血清中DAO、D-LA含量隨毒素劑量的增加而升高，各處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 DON對(duì)斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響

由表4可見(jiàn)：高劑量組十二指腸腸絨毛高度顯著高于對(duì)照組與低劑量組(P<0.05)，低劑量組腸絨毛則顯著低于其他組(P<0.05)?？漳c絨毛高度隨毒素劑量的增加而顯著降低(P<0.05)?；啬c對(duì)照組絨毛顯著高于毒素處理組(P<0.05)，且處理組腸絨毛隨毒素劑量的升高而降低，但不顯著。各腸段隱窩深度均無(wú)顯著變化。此外，絨毛高度與隱窩深度的比值所呈趨勢(shì)與絨毛高度相一致。

表2DON對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

Table2Effect of DON on serum biochemical indexes in weanling piglets

指標(biāo) Indexes對(duì)照組 Control group低劑量組 Low-dose group高劑量組 High-dose group谷丙轉(zhuǎn)氨酶 ALT/(U·L-1)51.73±6.0952.50±9.0558.95±3.46谷草轉(zhuǎn)氨酶 AST/(U·L-1)112.8±7.35 a91.80±2.83 ab77.05±8.70 b堿性磷酸酶 ALP/(U·L-1)282.73±11.72 b341.50±9.01 ab374.03±24.09 aγ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 γ-GGT/(U·L-1)95.27±3.84 b105.03±9.41 b151.10±30.18 a總蛋白 TP/(g·L-1)59.30±2.9956.20±4.3154.03±3.45白蛋白 ALB/(g·L-1)27.73±4.2824.30±3.9326.30±2.43球蛋白 GLB/(g·L-1)31.57±2.32 31.90±7.5427.73±2.87白蛋白/球蛋白 ALB/GLB0.90±0.170.80±0.260.93±0.12尿酸 UA/(μmol·L-1)12.30±2.4610.60±1.8710.13±2.76尿素 UREA/(mmol·L-1)4.54±0.634.11±0.365.05±0.88肌酐 CREA/(μmol·L-1)65.83±6.52 c 84.33±2.37 b96.23±7.06 a淀粉酶 α-AMY/(U·L-1)1 557.50±170.41 b2 586.35±172.75 a2 570.60±74.23 a脂肪酶 LIP/(U·L-1)4.63±0.25 b5.40±0.44 ab6.00±0.56 a鈣 Ca/(mmol·L-1)2.48±0.162.30±0.222.36±0.28磷 P/(mmol·L-1)3.91±0.083.79±0.444.22±0.59肌酸激酶CK/(U·L-1)962.45±26.38 b1 326.03±382.25 b2 196.03±248.32 a

表3DON對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響

Table3Effect of DON on intestinal permeability in weanling piglets

指標(biāo)Indexes試驗(yàn)期experimental stage/d對(duì)照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group二胺氧化酶 DAO/(ng·L-1)028.23±3.1028.51±1.3428.61±1.386027.82±1.71 c31.71±3.88 b39.98±5.68 aD-乳酸 D-LA/(μg·L-1)064.21±5.74 70.18±12.6469.96±5.266062.41±14.11 c76.66±0.83 b 90.22±5.35 a

表4DON對(duì)斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)的影響

Table4Effect of DON on small intestinal morphology in weanling piglets

指標(biāo)Indexes腸段Intestinal segment對(duì)照組Control group低劑量組Low-dose group高劑量組High-dose group絨毛高度十二指腸 Duodenum 605.07±178.21 b480.76±126.18 c750.92 ±190.28 aVillus height/μm空腸 Jejunum551.35±120.10 a470.27±127.51 b416.91±125.85 c回腸 Ileum475.76±130.55 a363.28±106.80 b345.39± 101.29 b隱窩深度十二指腸 Duodenum 1 007.74±218.271 020.87±178.101 034.83±182.02Crypt depth/μm空腸 Jejunum764.09±152.84781.50±135.83771.74±192.22回腸 Ileum673.56±121.44700.27±158.92674.56±150.95絨毛高度/隱窩深度十二指腸 Duodenum 0.60±0.13 b0.48±0.09 c0.70±0.16 aVillus height/Crypt depth空腸 Jejunum0.74±0.12 a0.67±0.15 b0.55±0.12 c回腸 Ileum0.70±0.17 a0.52±0.12 b0.50±0.13 b

由圖1可見(jiàn)：對(duì)照組的各腸段腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞數(shù)量較多，未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化；低劑量組十二指腸與空腸腸絨毛高度降低，杯狀細(xì)胞減少，其中十二指腸絨毛在高度降低的同時(shí)寬度增加；高劑量組十二指腸與空腸絨毛較其余兩組稀疏，且基本無(wú)杯狀細(xì)胞，十二指腸腺萎縮，空腸腸絨毛粘連、斷裂；在毒素處理的2組中，回腸除絨毛高度降低、絨毛稀疏外，其他形態(tài)變化并不明顯。

圖1 斷奶仔豬小腸組織病理切片(×40)Fig.1 Histopathological section of small intestinal tissues in weanling piglets (×40)

3 討論

玉米是畜禽飼料中的主要能量來(lái)源，DON是玉米最常見(jiàn)的霉菌污染物之一。由于飼料存放環(huán)境的溫度、濕度不易控制，使得DON污染問(wèn)題越發(fā)嚴(yán)重。我國(guó)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 13078—2017中規(guī)定，豬配合飼料中DON最高限量為1 mg·kg-1，而歐盟關(guān)于仔豬飼料中DON的最高限量則更少，為0.9 mg·kg-1[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，豬在攝入含有0.6 mg·kg-1DON飼料后便可造成一定的器官損傷以及機(jī)體炎癥反應(yīng)[10]。本試驗(yàn)采用DON含量為1 mg·kg-1和2 mg·kg-1的飼糧進(jìn)行試驗(yàn)，以便為飼料的安全性應(yīng)用提供參照。

動(dòng)物出現(xiàn)氧化應(yīng)激的特征為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量活性氧，機(jī)體可通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)使得活性氧含量下降，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑包括ROS代謝酶，如SOD、GSH-Px以及CAT等[11]，此外還包括活性氮(RNS)，如NO等[12]，而MDA則是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，以上這些物質(zhì)在機(jī)體中的含量可以顯示動(dòng)物所受氧化應(yīng)激的程度。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，3 mg·kg-1DON可使斷奶仔豬血清中T-SOD、GSH-Px含量顯著降低。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，4 mg·kg-1DON可以顯著增加斷奶仔豬腎臟、回腸及空腸組織中的MDA含量，同時(shí)可以顯著降低血清中CAT的活性。本試驗(yàn)中所得結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

血清生化指標(biāo)是檢測(cè)動(dòng)物機(jī)體是否處在正常內(nèi)環(huán)境之中的重要指標(biāo)，一旦出現(xiàn)異常則提示相關(guān)臟器可能受到不同程度的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，高水平的γ-GGT及AST可以反映肝損傷或氧化應(yīng)激[15]，ALP升高可以反映DON誘導(dǎo)的全身毒性所引起的肝臟代謝異常[11]。本試驗(yàn)中，DON處理組血清中AST水平顯著下降，但γ-GGT與ALP含量顯著升高，這一結(jié)果與Wu等[2]、姬長(zhǎng)云等[16]研究結(jié)果一致。α-AMY與LIP主要存在于胰腺、腸黏膜中，其中α-AMY是判定胰腺炎的重要指標(biāo)之一[17]，LIP是檢測(cè)腸黏膜完整性的參數(shù)[18]。試驗(yàn)中DON污染飼料飼喂仔豬后，仔豬血清中α-AMY、LIP含量均顯著上升，表明仔豬胰腺可能受損，同時(shí)腸黏膜屏障被破壞。此外，試驗(yàn)中CREA升高說(shuō)明腎臟可能受到一定程度的損傷。

腸道屏障對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有保護(hù)作用，DAO主要位于腸上皮細(xì)胞中，是一種高活性的細(xì)胞內(nèi)酶[19]。腸道黏膜受損，細(xì)胞內(nèi)的DAO可進(jìn)入血液，最終使血液中DAO含量升高。此外，腸道屏障被破壞后，原本存在于腸腔內(nèi)的細(xì)菌代謝產(chǎn)物D-LA將進(jìn)入血液，使血液中D-LA含量升高[20]。本試驗(yàn)中，斷奶仔豬血清中DAO及D-LA含量隨飼料中毒素劑量的增加而升高，這也與Wu和Feng等[14，20]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明DON對(duì)腸道黏膜的通透性造成一定影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中含有12 μg·kg-1DON便可以使絨毛高度與隱窩深度之比降低[21]，而2～4 mg·kg-1或更高劑量的DON可使空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，空腸及回腸萎縮、腸絨毛變短[8，13，22]。本試驗(yàn)中，飼料含1 mg·kg-1DON即導(dǎo)致仔豬小腸腸絨毛高度降低，尤其是十二指腸的絨毛在高度降低的同時(shí)寬度明顯增加，這可能是由于絨毛通過(guò)自身的收縮從而達(dá)到恢復(fù)自身屏障功能的目的[23]。高劑量組中，雖然十二指腸腸絨毛較其他2組顯著增高，但其絨毛密度明顯降低，同時(shí)上皮層中杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且十二指腸腺萎縮，此外，空腸絨毛發(fā)生明顯粘連，表明2 mg·kg-1DON污染的飼糧可以對(duì)腸道造成更加嚴(yán)重的損傷。

綜上所述，本試驗(yàn)中所使用的DON濃度可以導(dǎo)致斷奶仔豬機(jī)體氧化應(yīng)激，引起部分血清生化指標(biāo)異常，同時(shí)對(duì)小腸黏膜形態(tài)及腸道通透性也造成一定損傷。試驗(yàn)中所使用的1 mg·kg-1DON為豬配合飼料國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，但足以使斷奶仔豬產(chǎn)生氧化應(yīng)激并且使腸黏膜及其他臟器受到損傷，因此可推斷仔豬配合飼料中霉菌毒素DON的含量應(yīng)低于1 mg·kg-1。