細(xì)菌單雜交方法在篩選甲基營養(yǎng)菌甲醇脫氫酶啟動子結(jié)合蛋白中的應(yīng)用

鄒琪琪，齊姍姍，謝錄翰，辛 琪，李俊樂，張夢寧，葛 欣

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

甲基營養(yǎng)菌(Methylovorus)是一類能夠利用甲醇等一碳碳源生存的微生物，是研究一碳代謝的模式菌，同時，甲基營養(yǎng)型細(xì)菌代謝產(chǎn)物非常豐富，是多種重要化合物工業(yè)生產(chǎn)的候選菌株[1]。其代謝產(chǎn)物吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，簡稱PQQ)是繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸之后發(fā)現(xiàn)的第三類氧化還原酶輔酶，其具有多種生理功能，PQQ具有較強(qiáng)清除氧自由基的作用，能夠刺激動植物生長，防治心腦疾病、肝損傷、促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)等功能[2-4]。

甲醇脫氫酶(methanol dehydrogenase，MDH)MDH是甲基營養(yǎng)菌對甲醇利用和生物氧化的關(guān)鍵酶，是一種以PQQ為輔基的醌蛋白，其結(jié)構(gòu)是由2個亞基組成，為α2β2的四聚體。每分子酶含有2分子PQQ和2分子Ca2+，且它們均位于酶活性中心處，在酶的催化反應(yīng)中起重要作用。在甲基營養(yǎng)菌中，甲醇的氧化是通過甲醇脫氫酶進(jìn)行的，它催化甲醇氧化成甲醛。甲醇脫氫酶與甲醇及PQQ的結(jié)構(gòu)和催化具有一定的聯(lián)系，PQQ的構(gòu)型變化是由甲醇脫氫酶酶促反應(yīng)誘導(dǎo)的[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MDH對甲醇活力較低并不是酶本身的原因，而是相應(yīng)的底物和某些協(xié)助因子未能發(fā)揮最佳作用所造成的。李大攀等[6]敲除PQQ依賴的MDH基因后，MDH的活力及氧化甲醇的能力下降，說明對甲醇的利用是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。王冠芳等[7]提純MDH進(jìn)行活性檢測及對底物催化專一性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)依賴PQQ甲醇脫氫酶對底物催化專一性差。李淼鑫等[8]從甲基營養(yǎng)菌中擴(kuò)增甲醇脫氫酶(MDH)基因，并在大腸埃希菌中表達(dá)，檢測其活性，考察該基因?qū)量┼?PQQ)產(chǎn)生的影響，該基因能夠在大腸埃希菌中表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性；提高M(jìn)DH的表達(dá)水平對甲基營養(yǎng)菌PQQ的生物合成有一定影響。甲醇作為某些甲基營養(yǎng)菌株的惟一碳源，對菌體生長和PQQ生物合成的影響較大，甲醇脫氫酶是同化甲醇并為菌體生長提供能量的關(guān)鍵酶，醌酶的表達(dá)水平對PQQ具有一定影響。本研究利用細(xì)菌單雜交技術(shù)，篩選與甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688[9](中國普通微生物菌種保藏中心，編號CGMCC4096)的甲醇脫氫酶啟動子有相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，為闡明甲醇脫氫酶在甲基菌生長和代謝產(chǎn)物合成中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，ddH2O 1 L調(diào)節(jié)pH至7.0，用于大腸埃希菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

表1菌株和質(zhì)粒

Table1Strains and plasmids

菌株與質(zhì)粒Strains and plasmids特征Character來源SourceE. coli XL1-BlueΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96relA1 lac[F' proAB lacIq ZΔM15 Tn5(kanr)]本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stockpTRGBacterial one-hybrid assay bait domain vector, Tetracycline本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stockpROMOTERDetection of protein-DNA interaction, Chloramphenicolr本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stockB2H Validation strainΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 hisB supE44 thi-1 recA1gyrA96 relA1 lac[F'lacIq HIS3 aadA Kanr]本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stockMethylovorus sp. MP688甲基營養(yǎng)菌Methylotrophic bacteria本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stockMethylobacteriumextorquens AM1甲基營養(yǎng)菌模式菌株Model strain of methylotrophic bacteria本實(shí)驗(yàn)室保藏Laboratory stock

表2本研究中使用的引物

Table2Primers used in this study

引物Primers序列Sequences用途UseLuxR1CGGGATCCATGAAAAAAGCGAATGATGGAATTCCTAAATCTTGAGTTTGCTTCTPCR of LuxR1 sequenceLuxR2CGGGATCCATGAGTGAAGAAATTATCCGGCCCTCGAGTCAGCTATCGATCAAGCCATPCR of LuxR2 sequenceLuxR3CGGGATCCATGCAAGGTGCAGTAAGAGCCCTCGAGTCACGTTTTGATGATGTTGPCR of LuxR3 sequenceLuxR4CGGGATCCATGCCTGCAGATAAAAAAAGACTAGTCTAATCGACCAGATTGTTTTTPCR of LuxR4 sequenceLuxR5CGGGATCCATGCGCGATATTTTCATTTCTGGGAATTCTCAGCCCTGTCGATCATTCAGPCR of LuxR5 sequenceLuxR6CGGGATCCATGAAACACATTATTGTCGTGGGGAATTCTTAACGAGGCTGGAAAATATAAPCR of LuxR6 sequenceLuxR7CGGGATCCATGGATTTCACATCTGGCAATGGAATTCCTACCCTTTTCCCAGGTAATCPCR of LuxR7 sequenceLuxR8CGGGATCCATGCGCATACACAATGTCACCCTCGAGTCAGGTATTTAGAAGGCGATPCR of LuxR8 sequenceLuxR9CGGGATCCATGTTTATTACCAAAGAACTAACCCCCTCGAGTCATGAGGCCCGTGGPCR of LuxR9 sequenceLuxR10CGGGATCCATGAGCATCCCCAGTAACCGGAATTCTTACTTTTTACGATGGGCCPCR of LuxR10 sequenceLuxR11CGGGATCCATGAAAAAAATATTATTGGTGGACGGAATTCTCATGTAATCAGGCCGTTCTPCR of LuxR11 sequenceLysR1CGGGATCCATGAATACCTCCCTCACCAGGAATTCCTAGATCAGCAGTTCATCCAPCR of LysR1 sequenceLysR2CGGGATCCATGATCGAAATCCGACATCGGAATTCTCACAGCAAACGTATGCCTPCR of LysR2 sequenceLysR3CGGGATCCATGCCCTCGGTCAAAAGGGAATTCTTAATCGATGGCGGCCPCR of LysR3 sequenceLysR4CGGGATCCATGAAGCTCGACCAACTCAGGAATTCTTAAGCGTCACCTCCCATPCR of LysR4 sequenceLysR5CGGGATCCATGAAGCTGGAAGCCAATGAGGAATTCTTACCGTTTGTGCTTTTCGCPCR of LysR5 sequenceLysR6CGGGATCCATGGATACCCTGCGTAGCAGGAATTCCTAGCGCATTCTCCACTCCPCR of LysR6 sequenceLysR7CGGGATCCATGGCAATGGACAGGTTTGGGAATTCTTATCTGGAAGCGCCATTGPCR of LysR7 sequenceLysR8CGGGATCCATGCGCGTACTGGTAGCCGGAATTCCTAAAGATGGGGATGCGCPCR of LysR8 sequenceLysR9CGGGATCCATGTTTAGAATTAGCCTGGATGCGGAATTCTCAGGGGAAACCTTTACCGPCR of LysR9 sequenceLysR10CGGGATCCATGCATGATCTCAATTTGATGGGGAATTCTCAACGCGCATCCCAATPCR of LysR10 sequenceLysR11CGGGATCCATGAGCTTCAATATTATTTTGAAGGAATTCTTAGCGATAAAGGTAAGTGTTTPCR of LysR11 sequenceTetR1CGGGATCCATGACTGAACAGGAAAAGGAATTCTTACTTGCTTGGCCAATTCAPCR of TetR1 sequenceTetR2CGGGATCCATGGTACGCAAAACCAAAGCCCTCGAGTTATGCGTTTTTGTTCTTTCGPCR of TetR2 sequenceTetR3CGGGATCCATGTCACCCCCCACCCGGAATTCTCATGATGCTTGCTCCCCPCR of TetR3 sequenceTetR4CGGGATCCATGCGCGAATATATTCTGGAGGGAATTCCTAGGGGGCAGATGCTATCAGTAPCR of TetR4 sequenceTetR5CGGGATCCATGGTCAAATCCCAACGCGGAATTCCTATTTCCCCTGCCTGACTAAPCR of TetR5 sequenceTetR6CGGGATCCATGACCACTTCCCAGCCCGGAATTCTCAGCGACTTGCAGTTTCGPCR of TetR6 sequenceTetR7CGGGATCCATGGCACGCAAAACAAAGGAATTCCTAGGGTCTCGCCGGCPCR of TetR7 sequenceTetR8CGGGATCCATGATGACCATCATGAATAAAGGAATTCTTACTTGATGGCTTTGTAGTGPCR of TetR8 sequenceTetR9CGGGATCCATGTCTCCATTACGGGCGGAATTCTCAGCTTTTAAGTGCGTTAPCR of TetR9 sequenceTetR10CGGGATCCATGGCTGGAGAACGCAACCCTCGAGTCAGTTGATCAGCAGCCCPCR of TetR10 sequence

篩選培養(yǎng)基：瓊脂粉1.5 g，ddH2O 76 mL，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min，瓊脂冷卻至70 ℃加入10 mL10×M9 salts，混合均勻，待混合物冷卻至50 ℃時，加入M9 Media Additive 13.5 mL，氯霉素100 μL，鏈霉素100 μL，四環(huán)素50 μL，3-amino-1，2，4-triazole (3-AT) 1 mL。用于單雜交篩選，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.1.3 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、純化PCR產(chǎn)物試劑盒均購自全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自Thermo公司。

1.2 DNA基本操作與分析

大腸埃希菌質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物擴(kuò)增、 DNA的限制性酶切與酶連反應(yīng)、酶連產(chǎn)物和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、DNA凝膠電泳等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[17]。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子亞文庫的構(gòu)建

使用關(guān)鍵詞“regulator”“sigma”“sensor”“two component”對MP688全基因注釋信息(GenBank編號：NC_014733.1)和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行搜索，找到相關(guān)基因的核苷酸序列即為候選轉(zhuǎn)錄因子序列。我們分類查找到LuxR、LysR、TetR家族特異性轉(zhuǎn)錄因子，以MP688菌株的基因組為模板PCR擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)錄因子共計(jì)32個。將各轉(zhuǎn)錄因子與文庫載體pTRG進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，查找合適的酶切位點(diǎn)BamHⅠ、EcoRⅠ或XhoⅠ，進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，得到的一系列質(zhì)粒即構(gòu)成了甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688的轉(zhuǎn)錄因子亞文庫。

1.4 細(xì)菌單雜交篩選模型建立與應(yīng)用

1.4.1 共轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建

由于B2H validation strain感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒中存在卡那霉素抗性基因，文庫載體含有四環(huán)素抗性基因，而報(bào)告質(zhì)粒中存在氯霉素抗性基因，因此在含3種抗生素的培養(yǎng)基上生長的菌落可以視為已經(jīng)轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒，即共轉(zhuǎn)化成功。將文庫載體和重組報(bào)告質(zhì)粒各8 μL共轉(zhuǎn)化到50 μL B2H validation strain感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到含卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～14 h，長出的菌落即為共轉(zhuǎn)化菌株。

1.4.2 點(diǎn)種及培養(yǎng)

接種所構(gòu)建的共轉(zhuǎn)化菌株單菌落至LB液體培養(yǎng)基(卡納霉素、四環(huán)素、氯霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)。將篩選平板與對照保存平板(添加有3種抗性的LB平板)置于超凈工作臺中，適當(dāng)打開平皿蓋以吹干培養(yǎng)基表面的多余水分，并且保證培養(yǎng)基表面不會過于干燥，取所接種的共轉(zhuǎn)化子菌液2 μL分別點(diǎn)種于篩選平板及對照保存平板，點(diǎn)種后將平板正向置于30 ℃培養(yǎng)箱中約30 min，待所點(diǎn)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置避光培養(yǎng)。

1.4.3 篩選平板上菌落生長情況的觀察

將篩選平板與對照平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12 h，取出觀察并記錄菌落生長情況，主要包括菌落是否生長、菌落形態(tài)、相對生長趨勢等。平板繼續(xù)倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔12 h左右按照相同標(biāo)準(zhǔn)觀察并記錄篩選平板，培養(yǎng)至第3天為止。啟動子與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的強(qiáng)弱主要表現(xiàn)在菌落的生長情況，因此可根據(jù)菌株生長情況判斷各轉(zhuǎn)錄因子是否與甲醇脫氫酶啟動子發(fā)生相互作用及相互作用的強(qiáng)弱。

1.4.4 陰性對照自激活驗(yàn)證及3-AT濃度確定

將pTRG空質(zhì)粒和克隆有甲醇脫氫酶啟動子序列的pROMOTER質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到報(bào)告菌株B2H validation strain中，在篩選培養(yǎng)基中觀察報(bào)告基因的表達(dá)狀況。若有菌落生長則在培養(yǎng)基中添加不同濃度的3-AT，直至培養(yǎng)基上無菌落生長。

1.4.5 甲基營養(yǎng)菌中DNA-蛋白質(zhì)相互作用的陽性對照的篩選

以模式菌MethylobacteriumextorquensAM1的AM1_glyA、AM1_qsr基因?yàn)閰⒖迹cMethylovorussp. MP688全基因組進(jìn)行同源分析，得到同源性較高的基因mpq_0872、mpq_1945，并查找RNA聚合酶的不同亞基得到MPQ_0345、MPQ_2317、MPQ_0345CTD的相關(guān)基因序列，以此作為陽性對照的候選因子。

1.4.6 MPQ_1945陽性對照蛋白的構(gòu)建與表達(dá)

將PCR擴(kuò)增的mpq_1945基因經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，選擇表達(dá)載體pET-15b，用NdeⅠ和BamHⅠ線性化此載體，然后用T4連接酶連接雙酶切的mpq_1945基因片段及線性化pET-15b載體，構(gòu)建mpq_1945的表達(dá)質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中。挑選正確的轉(zhuǎn)化子菌株接種至含1 μg·mL-1氨芐抗生素培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后以1%接種量轉(zhuǎn)接該菌液到100 mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600=0.4)后加入IPTG至終濃度依次為0.10、0.25、0.50 mmol·L-1，20 ℃誘導(dǎo)過夜培養(yǎng)，離心菌液收集表達(dá)菌體，所得菌體經(jīng)超聲波破碎(Pulse on 3 s，off 6 s)后，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用鎳柱親和層析法純化蛋白，10% SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)和純化情況。

1.4.7 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)

將mpq_0872基因啟動子的DNA片段和MPQ_1945蛋白以一定比例添加至1.5 mL離心管，加入10×反應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.5，100 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA，0.5 mmol·L-1MgCl2)混勻，4 ℃靜置孵育2 h，體系見表3。制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，體系總體積10 mL，含5×TBE 1mL，30%聚丙烯酰胺2.2 mL，80%甘油80 μL，10%過硫酸銨90 μL，四甲基乙二胺10 μL，去離子水6.62 mL。加樣前先在預(yù)冷的0.5×TBE 緩沖液中120 V預(yù)電泳10 min，電泳完畢后沖洗加樣孔。將混合樣品進(jìn)行點(diǎn)樣電泳，將電泳槽置于冰上或4 ℃環(huán)境中，恒壓100 V進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子亞文庫的構(gòu)建

LuxR、LysR、TetR家族轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)菌中普遍存在，并與多種次級代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)，通過對甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp. MP688全基因組及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的分析，并對LuxR、LysR、TetR家族的32個轉(zhuǎn)錄因子基因分類整理，結(jié)果表明，有11個轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆贚uxR家族，有11個轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆贚ysR家族，有9個轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆赥etR家族。針對LuxR家族、LysR家族轉(zhuǎn)錄因子基因設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的因子并與pTRG質(zhì)粒克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證，構(gòu)建成功的LuxR轉(zhuǎn)錄因子亞文庫有6個，分別為LuxR1、LuxR2、LuxR5、LuxR6、LuxR7、LuxR8；LysR轉(zhuǎn)錄因子亞文庫有5個，分別為LysR1、LysR2、LysR4、LysR5、LysR6。

表3EMSA反應(yīng)體系

Table3EMSA reaction system

反應(yīng)體系Reaction system12345啟動子Promoter/μL07777蛋白Protein/μL6640610×緩沖液10×Buffer/μL22222ddH2O/μL1257115體積Volume/μL2020202020

1，反應(yīng)體系中僅含有MPQ_1945蛋白； 2、3，反應(yīng)體系中含有mpq_0872基因的啟動子和MPQ_1945蛋白；4，反應(yīng)體系中僅含有mpq_0872基因的啟動子；5，反應(yīng)體系中含有mpq_0872基因的啟動子和陰性對照蛋白。

1，Reaction system contain protein MPQ_1945 only; 2-3，Reaction system contain promotermpq_0872 and protein MPQ_1945; 4，Reaction system contain promotermpq_0872 only; 5，Reaction system contain promotermpq_0872 and negative control protein.

2.2 陰性對照自激活驗(yàn)證及3-AT濃度確定

由于轉(zhuǎn)錄因子能夠與RNA聚合酶的α亞基融合表達(dá)，將文庫載體及報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化到宿主菌株中后，若調(diào)控蛋白和啟動子存在相互作用，α亞基便會牽引RNA聚合酶使其牢固地結(jié)合在目的啟動子區(qū)，從而激活之后的報(bào)告基因his3和aadA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了驗(yàn)證在沒有啟動子時該系統(tǒng)是否具有自激活現(xiàn)象，設(shè)計(jì)陰性對照共轉(zhuǎn)化菌株的單雜交篩選。結(jié)果表明，陰性對照菌株在篩選平板上生長，證明有自激活現(xiàn)象，在培養(yǎng)基中添加2～4 mmol·L-1的3-AT能夠抑制其自激活。陰性對照在濃度為2、3 mmol·L-1的3-AT下可以生長，當(dāng)濃度增至4 mmol·L-1時對照菌的生長被抑制，因而確定3-AT的最適篩選濃度為4 mmol·L-1，在此濃度下，能夠確保非特異性自激活被充分抑制，且抑制劑濃度最低。

2.3 甲基營養(yǎng)菌中DNA-蛋白質(zhì)相互作用的陽性對照的篩選

由于MethylobacteriumextorquensAM1和Methylovorussp. MP688均為甲基營養(yǎng)型菌株，具有同源性。為了尋找甲基營養(yǎng)菌中具有相互作用的陽性對照，我們以與AM1具有相互作用的轉(zhuǎn)錄因子QSR為參考，對Methylovorussp. MP688基因組進(jìn)行基因分析比對，將與AM1具有同源性的基因作為陽性候選基因并構(gòu)建共轉(zhuǎn)化菌株。細(xì)菌單雜交篩選中，以4 mmol·L-13-AT濃度為基準(zhǔn)，設(shè)定3-AT的濃度梯度為4、6、8、10 mmol·L-1。對其進(jìn)行細(xì)菌單雜交篩選，結(jié)果表明，隨著3-AT濃度的增加，含不同轉(zhuǎn)錄因子的菌株長勢發(fā)生變化，如圖2所示，在4 mmol·L-13-AT濃度下，AM1_QSR、MPQ_0345、MPQ_0345CTD、MPQ_1945正常生長；濃度為6 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_0345、MPQ_1945能夠生長；濃度為8 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_1945繼續(xù)生長；濃度為10 mmol·L-1時，AM1_QSR、MPQ_1945仍能正常生長，最終確定MPQ_1945作為甲基營養(yǎng)菌細(xì)菌單雜交篩選模型的陽性對照。在此濃度下，能確保非特異性自激活被充分抑制，而含有MPQ_0872和MPQ_1945相互作用的菌株生長良好。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子亞文庫的構(gòu)建流程Fig.1 The construction of transcription factor sublibrary

2.4 陽性對照蛋白表達(dá)

陽性對照蛋白MPQ_1945進(jìn)行IPTG濃度梯度優(yōu)化，最終在IPTG濃度為0.25 mmol·L-1時得到可溶性蛋白，用鎳柱親和層析進(jìn)行純化得到目的蛋白，如圖3所示。

1，MPQ_1945；2，AM1_QSR；3，MPQ_0345CTD；4，MPQ_0345；5，AM1-pTRG；6，MPQ_pTRG.圖2 陽性對照相互作用篩選Fig.2 The screening of positive control interaction

2.5 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)鑒定相互作用

細(xì)菌單雜交系統(tǒng)篩選出的DNA-蛋白質(zhì)間相互作用的蛋白是否可靠，我們結(jié)合凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。將篩選的陽性MPQ_1945蛋白和mpq_0872基因的啟動子進(jìn)行EMSA，反應(yīng)體系見表3，經(jīng)EB染色后，由于體系1沒有DNA，所以EB染色沒有條帶，體系2、3同時具有DNA和蛋白質(zhì)，兩者結(jié)合后電泳時比無蛋白質(zhì)的DNA游離的慢，因此EB染色滯后。體系4只有DNA，作為陽性對照DNA經(jīng)EB染色后呈游離帶，體系5同時含有DNA和蛋白質(zhì)，然而該蛋白質(zhì)是甲基菌的無關(guān)蛋白，以體系5作為陰性對照，經(jīng)EB染色后呈游離帶。EB染色結(jié)果如圖4所示，最終確定細(xì)菌單雜交系統(tǒng)能在甲基營養(yǎng)菌中應(yīng)用并具有可靠性。

A： 1，未誘導(dǎo)菌體蛋白；2，誘導(dǎo)菌體蛋白；3，誘導(dǎo)菌體上清；4，誘導(dǎo)菌體沉淀。B： 1，未誘導(dǎo)菌體蛋白；2，誘導(dǎo)菌體上清；3，掛柱后上清；4，Wash buffer洗脫；5～9，Elution Buffer洗脫液。A: 1，Uninduced bacterial protein; 2，Induced bacterial protein; 3，Induced bacterial supernatant; 4，Induced bacterial precipitation.B: 1，Uninduced bacterial protein; 2，Induced bacterial protein; 3，F(xiàn)low through after binding; 4，Elution by wash buffer; 5-9: Elution buffer.圖3 蛋白表達(dá)與純化Fig.3 Protein expression and purification

1，反應(yīng)體系中只有MPQ_1945蛋白；2、3，反應(yīng)體系中含有mpq_0872基因的啟動子片段與不同濃度的MPQ_1945蛋白；4，反應(yīng)體系中只含有mpq_0872基因的啟動子片段；5，反應(yīng)體系中含有mpq_0872基因的啟動子片段與陰性對照蛋白。1，Reaction system contain protein MPQ_1945 only; 2,3，Reaction system contain promoter mpq_0872 and different concentrations of protein MPQ_1945; 4，Reaction system contain promoter mpq_0872 only; 5，Reaction system contain promoter mpq_0872 and negative control protein.圖4 DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)Fig.4 DNA-protein EMSA assay

2.6 甲醇脫氫酶啟動子細(xì)菌單雜交篩選

2.6.1 甲醇脫氫酶啟動子序列分析

通過生物信息學(xué)預(yù)測(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)mpq_0771基因前有一個得分高的強(qiáng)啟動子，如圖5所示。該啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)以及可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)也標(biāo)識出。因此我們設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增了540 bp包含這部分功能區(qū)的片段，將構(gòu)建到pROMOTER的報(bào)告基因前，通過細(xì)菌單雜交篩選這些DNA位點(diǎn)的結(jié)合蛋白。

2.6.2 甲醇脫氫酶啟動子細(xì)菌單雜交篩選

通過觀察和記錄含有不同濃度抑制劑3-AT的篩選培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)化子的生長狀況，可知隨著3-AT濃度的增加各共轉(zhuǎn)化菌株長勢不同，部分長勢良好，部分長勢較弱，說明與甲醇啟動子有不同程度作用結(jié)果。篩選結(jié)果中無相互作用的有1個，弱相互作用的有2個，中等作用的有6個，結(jié)果見表5，當(dāng)3-AT濃度增加至15 mmol·L-1時陽性對照菌生長狀態(tài)趨于下降，而LuxR7、LuxR8的共轉(zhuǎn)化菌株長勢依舊良好，結(jié)果見圖6，表明LuxR7、LuxR8轉(zhuǎn)錄因子與報(bào)告載體上的甲醇脫氫酶啟動子具有很強(qiáng)的相互作用，相關(guān)結(jié)合蛋白的信息見表6。

下劃線，核心啟動子；粗體，-10區(qū)，-35區(qū)；黑色邊框，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。Underline，Core promoter; Bold，-10，-35; Black border，Transcription factor binding site.圖5 甲醇脫氫酶基因(mpq_0771)啟動子區(qū)域序列分析Fig.5 The sequence analysis of methanol dehydrogenase gene (mpq_0771) promoter region

表5細(xì)菌單雜交篩選

Table5The bacterial-one-hybrid screening

轉(zhuǎn)錄因子名稱Name of regulators3-AT的濃度 The concentration of 3-AT/(mmol·L-1)6 8 101215 結(jié)論ConclusionLuxR1++++++++--中ModerateLuxR2-----無NoneLuxR5+----弱WeakLuxR6++++++++++-中ModerateLuxR7+++++++++++++++強(qiáng)StrongLuxR8+++++++++++++++強(qiáng)StrongLysR1++++++++++++中ModerateLysR2++++++++++++中ModerateLysR4++++++++++-中ModerateLysR5+++--弱WeakLysR6++++++++++-中Moderate

A： 1，陽性對照； 2，陰性對照；3，LuxR7； B： 1，陽性對照；2，LuxR8；3，陰性對照。A： 1，Positive control; 2，Negative control; 3，LuxR7; B： 1，Positive control; 2，LuxR8; 3，Negative control.圖6 共轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果Fig.6 Co-transformation screening results

表6結(jié)合蛋白信息

Table6The information of binding proteins

結(jié)合蛋白Binding proteins功能注釋Function annotation序列號Gene ID分子大小Molecularweight/ku保守結(jié)構(gòu)域數(shù)ConserveddomainsMPQ_0747LuxR1Two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999558534.541MPQ_1056LuxR5LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999589422.551MPQ_1422LuxR6two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999626023.541MPQ_1431LuxR7LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999626938.282MPQ_1438LuxR-8two component LuxR family transcriptional regulatorGene ID: 999627622.552MPQ_1017LysR1LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999585533.001MPQ_1140LysR2LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999597833.331MPQ_2042LysR5LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999688033.441MPQ_2057LysR6LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999689533.551MPQ_1945LysR family transcriptional regulatorGene ID: 999678333.881

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的細(xì)菌單雜交系統(tǒng)從自身系統(tǒng)的驗(yàn)證及將已知的轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的相互作用作為對照來尋找最佳篩選條件，最終確定3-AT最適篩選濃度為4 mmol·L-1。由于細(xì)菌單雜交存在假陽性和假陰性的缺陷，我們用EMSA來進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的結(jié)果，EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單雜交結(jié)果一致，證明了細(xì)菌單雜交系統(tǒng)在甲基營養(yǎng)菌高通量篩選中的可行性[10-13]。

轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是一類細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)因子，通過與順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性。由于細(xì)菌mRNA分離困難，構(gòu)建細(xì)菌cDNA文庫一直是學(xué)術(shù)界難點(diǎn)，而通常細(xì)菌基因組文庫的建立又由于采用基因組隨機(jī)斷裂的方法，存在著一些缺點(diǎn)，如：插入片段的隨機(jī)性和定向性差等缺點(diǎn)，因此采用這種方式構(gòu)建細(xì)菌cDNA文庫對其文庫的覆蓋度和效率要求較高。本實(shí)驗(yàn)基于甲基營養(yǎng)菌的全基因組序列，對其進(jìn)行分析找到和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的基因序列，包括LuxR、LysR、TetR家族轉(zhuǎn)錄因子總計(jì)32個，最后通過逐一擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子基因，來構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子亞文庫。從而使文庫的庫容量和效率大大增加，同時由于篩選范圍的縮小，使篩選目標(biāo)更具定向性。比如，甲基營養(yǎng)菌是合成PQQ的主要菌株，pqqABCDE等PQQ合成模塊基因雖然在不同菌株中存在差異，但這些基因的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的調(diào)控[14-15]，目前關(guān)于PQQ合成調(diào)控的研究較少。本文建立的方法可用于高通量篩選PQQ合成模塊基因的啟動子結(jié)合蛋白，最終闡述甲基營養(yǎng)菌PQQ合成調(diào)控機(jī)制。

在基因的表達(dá)調(diào)控中，參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子是各種蛋白質(zhì)，而核酸和蛋白質(zhì)又是構(gòu)成生命體最為重要的兩類生物大分子，因此研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、DNA-蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用對于人們在分子水平上深入理解各種生物學(xué)過程至關(guān)重要[16]。本實(shí)驗(yàn)對細(xì)菌單雜交系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化使其成功應(yīng)用于甲基營養(yǎng)菌，并利用細(xì)菌單雜交技術(shù)的獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)，篩選轉(zhuǎn)錄因子亞文庫，成功從32個轉(zhuǎn)錄因子中篩選出與甲基營養(yǎng)菌甲醇脫氫酶啟動子相互作用的蛋白，共計(jì)11個。這些與甲醇脫氫酶啟動子有相互作用的蛋白又表現(xiàn)出強(qiáng)弱程度的不同。為進(jìn)一步闡明甲醇脫氫酶在甲基菌生長和代謝產(chǎn)物合成中的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時構(gòu)建成功的文庫也能夠在其他基因轉(zhuǎn)錄因子篩選中得到應(yīng)用，為構(gòu)建PQQ高產(chǎn)菌株及詮釋PQQ合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。