苧麻脫膠細(xì)菌菌株的篩選、分類鑒定與多樣性分析

鄭科，段盛文，成莉鳳，馮湘沅，劉正初，曾潔，郜明強(qiáng)，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

苧麻（Boehmeria niveaL.）等麻類韌皮的纖維細(xì)胞被大量鍵合型非纖維素物質(zhì)包被或鑲嵌，很難采用簡單的物理加工方法提取［1］。以大量酸、堿處理為技術(shù)核心的化學(xué)脫膠方法，存在對環(huán)境污染嚴(yán)重等弊端。現(xiàn)代生物脫膠技術(shù)是麻類加工技術(shù)的發(fā)展方向，主要分酶脫膠和菌脫膠兩類［2］。生產(chǎn)試驗(yàn)中，酶制劑脫膠成本相對較高，微生物脫膠技術(shù)更加成熟和實(shí)用［3］。但生物脫膠技術(shù)在生產(chǎn)中大規(guī)模穩(wěn)定應(yīng)用依然少見，主要?dú)w因于缺少脫膠能力強(qiáng)、性狀穩(wěn)定的菌種，故脫膠微生物已成為麻類脫膠技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵［4］。國內(nèi)外報道的脫膠微生物主要有Erwinia carotovora、Pec-tobacterium carotovorum、Bacilluspumilus、Bacillussubtilis、Aspergillusniger等細(xì)菌和真菌［5－6］。有研究人員通過基因克隆定位誘變［7］、構(gòu)建工程菌株等現(xiàn)代生物技術(shù)手段來提高脫膠菌種選育的效率［8］，或者以混合菌的方式進(jìn)行脫膠研究［9］，這兩種途徑均需要合適的脫膠菌株作為支撐。因此，在微生物脫膠研究中，發(fā)掘生長條件簡單、生長周期短的可培養(yǎng)細(xì)菌更具實(shí)踐意義。

本研究從不同生境中采集樣品，以苧麻韌皮原料為基質(zhì)，通過富集、分離與純培養(yǎng)，進(jìn)行分離篩選，獲取具有脫膠功能的細(xì)菌資源，通過形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA測序，對菌種進(jìn)行初步的分類鑒定和多樣性分析，并從中篩選出代表性的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶等功能分析，旨在為揭示不同脫膠菌的差異和關(guān)聯(lián)提供參考，同時為脫膠微生物遺傳改良、脫膠復(fù)合菌群的構(gòu)建等生物脫膠技術(shù)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苧麻原麻：產(chǎn)自湖南長沙，手工剝制的去殼干皮。

分離基質(zhì)：在湖南長沙和海南三亞2個地區(qū)的麻類作物田地土壤、麻類植株腐殖質(zhì)、喂養(yǎng)苧麻飼料的牛羊糞便、椰殼麻堆肥4類環(huán)境的不同部位取20個樣品，作為細(xì)菌分離基質(zhì)。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

細(xì)菌DNA提取、PCR擴(kuò)增等試劑產(chǎn)自TaKaRa公司。果膠（柑橘，BR）和木聚糖（樺木，GR）產(chǎn)自Sigma公司。其它常規(guī)試劑為國產(chǎn)（BR或AR）。

富集培養(yǎng)基：生苧麻30.0 g，牛肉膏1.5 g，NaCl 1.5 g，蛋白胨3.0 g，自然pH，蒸餾水定容至500 mL，121℃滅菌30 min。

初篩麻瓶、復(fù)篩麻瓶：225 mL滅菌水，接種后加入15.0 g滅菌原麻。

分離平板培養(yǎng)基：果膠 5.0 g／L，蛋白胨1.5 g／L，NaCl1.5 g／L，瓊脂15.0 g／L，自然 pH，121℃滅菌30 min。

木聚糖酶活性檢驗(yàn)培養(yǎng)基：NaCl 6.0 g／L，MgSO40.1 g／L，KH2PO40.5 g／L，CaCl20.1 g／L，（NH4）2SO42.0 g／L，K2HPO42.0 g／L，木聚糖 5.0 g／L，酵母粉 1.0 g／L，瓊脂 15.0 g／L，pH 7.0。

剛果紅染色液：用蒸餾水溶解剛果紅，終濃度為0.1%（w／v）。脫色液：終濃度為1.0 mol／L的NaCl溶液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的初篩、分離和純化

富集培養(yǎng)：稱取菌樣基質(zhì)約30 g，加入300 mL滅菌水中，120 r／min震蕩培養(yǎng)10 min，雙層紗布過濾，取濾液30 mL，加入富集培養(yǎng)基中，于33～35℃、80 r／min震蕩發(fā)酵2 d。

初篩：取以上樣品富集培養(yǎng)液10 mL分別加入初篩麻瓶中，33～35℃、80 r／min震蕩發(fā)酵2 d，觀察原料變化，能使原麻明顯變軟或纖維分散的發(fā)酵液中可認(rèn)為有脫膠菌群?？瞻讓φ盏穆槠恐?，加入純凈水代替富集培養(yǎng)液。

分離與純化：取富集培養(yǎng)液用果膠瓊脂平板進(jìn)行稀釋涂皿，平板于34～36℃培養(yǎng)36 h，分離出單菌落；對分離的菌株進(jìn)行純化、菌落和菌體形態(tài)觀察以及革蘭氏染色試驗(yàn)。

1.3.2 16S rDNA分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA，由廣州基迪奧公司采用通用引物27F、1492R進(jìn)行16S rDNA測序；序列在GenBank進(jìn)行BLAST比對分析，選擇相似性最高的種屬做為菌種鑒定初步結(jié)果；利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 多樣性分析

對篩選的細(xì)菌進(jìn)行種群分類、分離基質(zhì)分類，并進(jìn)行形態(tài)多樣性以及功能多樣性研究。采用多樣性統(tǒng)計方法，對不同樣品基質(zhì)群落類型中的脫膠菌種進(jìn)行物種多樣性研究，包括多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度、均勻性以及相似性指數(shù)。

Shannon多樣性指數(shù)H′＝－∑（PilnPi）＝－∑（Ni／N）ln（Ni／N），Ni是第i個物種的個體數(shù)，N是全部物種的總個體數(shù)；Simpson優(yōu)勢度指數(shù)C＝∑（Pi）2＝∑（Ni／N）2；Pielou均勻度指數(shù)E＝H′／lnS，H′是多樣性指數(shù)，S是物種的數(shù)目；群落相似性Jaccard指數(shù)Cs＝c／（a＋b－c），a為A群落物種數(shù)，b為B群落物種數(shù)，c為A、B兩群落共有的物種數(shù)［10，11］。

1.3.4 脫膠功能復(fù)篩

對純培養(yǎng)單菌進(jìn)行脫膠能力的篩選：采用苧麻脫膠實(shí)效法，將純培養(yǎng)菌液加入復(fù)篩麻瓶，33～35℃、120 r／min震蕩發(fā)酵，并設(shè)空白對照，發(fā)酵36 h，以是否明顯發(fā)生原麻變軟或纖維分散判斷是否脫膠。

1.3.5 木聚糖酶檢驗(yàn)

采用透明圈法，測量計算水解透明圈直徑與菌落直徑的比值，對復(fù)篩產(chǎn)生的菌種進(jìn)行產(chǎn)木聚糖酶的驗(yàn)證。以本團(tuán)隊選育的脫膠菌E．carotovora CXJZ95－198為對照（CK）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與篩選結(jié)果

經(jīng)富集和初篩，20個樣品全部具有一定的脫膠能力，形成20個脫膠復(fù)合菌群。因果膠降解能力是脫膠菌的重要特性，所以菌群通過在果膠瓊脂平板（含少量氮源和無機(jī)鹽）上生長分離，然后進(jìn)一步篩選，根據(jù)基本形態(tài)去掉源自同一個樣品的重復(fù)菌株，共獲得78個苧麻脫膠菌種。

2.2 16S rDNA分子鑒定

通過16S rDNA分子鑒定，將篩選的78個菌種初步分為17個屬，分別為無色桿菌屬（Achromobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜冷芽孢桿菌屬（Psychrobacillus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella），至少 27種（表 1）。其中，芽孢桿菌類占70.51%，這與其他生物脫膠類報道中芽孢桿菌比較多見的情況一致［5－9］。4類基質(zhì)中，麻類腐質(zhì)中篩選出的菌種數(shù)最多，占43.59%。

將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，除2個（賴氨酸芽胞桿菌和鞘氨醇桿菌）同源性為95%和97%以外，其它均在99%以上，種屬鑒定的可信度較高。對應(yīng)參考菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖1可以看出，篩選的脫膠可培養(yǎng)細(xì)菌主要聚為8大類，其中7大類基本為芽孢桿菌類細(xì)菌，屬革蘭氏陽性菌，另外聚成一大類的基本為革蘭氏陰性菌。

表1 脫膠菌種與其對應(yīng)的分離基質(zhì)Table 1 The degumming bacteria and their habitats

續(xù)表1

圖1 脫膠細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育示意圖Fig.1 Cluster analysis for degumming bacteria based on 16S rDNA sequencing

2.3 多樣性分析

對于來源于不同基質(zhì)的菌種，其多樣性指數(shù)如表2所示。多樣性指數(shù)按麻類腐質(zhì)、牛羊糞便、麻園土、堆肥依次下降。麻類腐殖質(zhì)中的脫膠菌含量豐富，是分離專用菌種的較好基質(zhì)。堆肥中的脫膠細(xì)菌豐富程度相對較低，但是堆肥優(yōu)勢度相對明顯，這可能是因?yàn)槎逊手杏写罅恳瑲ぐl(fā)酵物，成分和發(fā)酵條件較為特殊，其菌株已經(jīng)經(jīng)歷了發(fā)酵過程的自然篩選。均勻性都較好，這與初篩、分離時去掉同一樣品形態(tài)重復(fù)菌株有關(guān)。

表2 不同分離基質(zhì)的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of different habitats

表3所示來源不同基質(zhì)菌種的相似性指數(shù)，所有樣品來自于2個地理環(huán)境差異很大的地區(qū)，而且同一個地區(qū)的每個取樣生境差異大，所以4類樣品間整體相似度不高。堆肥和其它樣品都極不相似，說明其提供給微生物的營養(yǎng)和溫度等條件專一性比較強(qiáng)。這與麻類脫膠微生物資源在廄肥中的多樣性研究結(jié)果相似［11］。

表3 不同分離基質(zhì)的相似性指數(shù)Table 3 Similarity indexes of different habitats

2.4 脫膠功能復(fù)篩

通過對78個菌種進(jìn)行苧麻脫膠功能復(fù)篩，有10個菌種分別在24 h內(nèi)能夠使苧麻明顯脫膠。編號為：H006、H021、H028、H032、H038、H046、H050、H056、H060、H096。

圖2 有明顯脫膠效果的苧麻試樣Fig.2 Ramie samples obviously degummed

2.5 木聚糖酶活力驗(yàn)證

對以上10株有顯著脫膠功能的菌進(jìn)行水解透明圈試驗(yàn)，結(jié)果表明，大部分菌株具有分泌木聚糖酶的能力，其中H021和H056與對照菌株相比，分解木聚糖的能力顯著。10株菌株的木聚糖酶水解圈結(jié)果如圖3和表4所示。

圖3 分泌木聚糖酶形成的水解圈比較Fig.3 Comparison of hydrolyzed circle caused by bacteria.

表4 復(fù)篩出的10個菌種的信息Table 4 Information of the 10 strains further studied

3 討論

本研究篩選、分離出數(shù)量較多的具有一定脫膠功能的細(xì)菌。以苧麻韌皮原料為培養(yǎng)基具有良好的富集和篩選效果，而采用果膠瓊脂平板分離培養(yǎng)可進(jìn)一步提高篩選的準(zhǔn)確性。本研究篩選出的菌種具有降解苧麻和果膠的能力，在此基礎(chǔ)上，采用簡易的脫膠實(shí)效法和木聚糖透明圈法對細(xì)菌的脫膠功能進(jìn)行了初步鑒定。但微生物脫膠酶系復(fù)雜，有脫膠能力的微生物究竟是哪些酶在起作用仍不完全清楚。本研究中對脫膠效果的判斷并不全面，所篩選的脫膠菌株可能產(chǎn)生纖維素酶，進(jìn)而對纖維產(chǎn)品質(zhì)量帶來不利影響。因此，這些細(xì)菌的產(chǎn)酶特性還有待進(jìn)一步研究。

物種多樣性分析表明，通過麻類作物種植土壤、麻類腐殖質(zhì)、牛羊糞便和堆肥等麻類植株所處的環(huán)境和植物降解環(huán)境里的基質(zhì)能分離出大量功能菌種。麻類腐殖質(zhì)所含功能菌種豐富，廄肥等只能適合于特定的類群生長，種類較少。本研究只采用了單一培養(yǎng)基進(jìn)行分離，培養(yǎng)條件也限定在比較狹窄的范圍，對微生物多樣性反映有一定局限。微生物資源多樣性研究需要足夠大的樣本量，如果取樣和分離的菌種數(shù)量少，或去掉同一樣品中的重復(fù)菌株，則影響多樣性分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，富集后的菌群表現(xiàn)出脫膠能力，這其中可能有不可培養(yǎng)微生物的作用。

本研究篩選出的賴氨酸芽胞桿菌（Lysinibacillus sp．）和鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp．），此前報道中極少見到應(yīng)用于麻類脫膠，且比對的相似性較低，具備潛在新種的可能，值得深入研究。

雖然16S rDNA分子鑒定效率高，但少數(shù)菌種未能鑒定到種。且聚類分析中發(fā)現(xiàn)，有些分子鑒定結(jié)果表明應(yīng)該聚為一組的菌卻單獨(dú)相聚（如H003、H060、H100）；少數(shù)菌種比對的相似性不高。因此，部分菌種的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建需要完善和改進(jìn)，要更精確地對篩選出的菌種進(jìn)行鑒定，還需要結(jié)合外觀形態(tài)、生理生化特征進(jìn)行鑒定。