工業(yè)大麻性別鑒定研究進展

崔丹丹，楊瑞芳，佘瑋，李林林，蘇小惠，王繼龍，崔國賢

（湖南農業(yè)大學苧麻研究所，長沙410128）

大麻（Cannabis sativaL.），別稱火麻、線麻，大麻科大麻屬一年生草本植物。工業(yè)大麻又名漢麻，是指四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻品種。大麻是地球上最古老的作物之一，起源于中國，栽培利用歷史超過一萬年［1］。在中國，大麻的利用以紡織和食用為主。作為一種天然紡織原料，大麻纖維具有吸濕、散濕、透氣、消音吸波、耐熱、耐曬、耐腐蝕、抗靜電、防紫外線、抑菌等特點［2］，其產品受到越來越多消費者的青睞；作為一種食用油，大麻籽仁油的不飽和脂肪酸含量高達88.54%以上［3］，人體自身不能合成的亞油酸和 α－亞麻酸在大麻籽油中的比例與人體的營養(yǎng)需求十分接近［4］，其具有降壓調脂、改善消化系統(tǒng)、益智健腦、助睡眠、抗衰老等功效［5］。世界長壽之鄉(xiāng)廣西巴馬地區(qū)的巴馬火麻油更有“長壽油”的美譽，名揚海內外。在歐洲，超過95%的大麻籽作為動物飼料（鳥食、釣餌），其余的用于以全麻籽形式生產的食物［6］。國外還使用稀酸／蒸汽聯(lián)合預處理工業(yè)大麻的方法來生產乙醇［7］。

多數大麻為雌雄異株，少數雌雄同株。因雄麻纖維質量優(yōu)于雌麻，生產上，若以收獲纖維為目的，則期望主要種植雄麻；若以收獲籽粒為目的，則期望主要栽培雌麻。但是，目前尚無準確鑒定大麻種子性別的方法，幼苗期也較難分辨，且大麻的性別表達受多種因素影響，如溫度、光周期、激素、重金屬鹽等都能誘導大麻性別表達。不能根據收獲目的使大麻雌雄株合理搭配，嚴重制約了工業(yè)大麻產業(yè)的發(fā)展。本文概述了大麻種子鑒別、性別表達及雌雄株早期鑒定方法，以期為工業(yè)大麻產業(yè)發(fā)展提供參考。

1 大麻種子性別無損鑒定

在生產上使用的“大麻種子”實則為其果實，卵圓形瘦果，灰白或灰褐色，果皮堅硬。《齊民要術》有載，“凡種麻，用白麻子”，“止取實者，種斑黑麻子”，即顏色偏白，兩頭較尖，比較輕的種子是不結實的雄麻，而色較黑，比較堅實而重的種子則是雌麻，所以，要收麻皮則用白麻子，要收種子則用黑麻子［8］；《農政全書》有載，“種子取斑黑者為上”；《圖經本草》有載，“農家擇其子之斑黑文者，謂之雌麻，種之則結子繁，他子則不然也”。這些古代農業(yè)書籍的經驗總結均顯示，顏色較黑、籽粒飽滿的種子多為雌麻，顏色較淺，粒重較輕的種子多為雄麻。近年來，谷雨田［9］的研究也發(fā)現，大麻種子粒大飽滿多為雌株，反之，植株多為雄株。在種子重量與性別相關性研究方面，曲超等［10］對栝樓種子研究發(fā)現，隨著種子重量的增加，雄株分化比例減少，雌株比例增加。此現象可以從植物生理生化的角度解釋為：為了生殖生長需要，雌麻種子需要儲存更多的營養(yǎng)物質來抵御在生長過程中可能遇到的各種生存壓力，使得雌麻種子重量高于雄麻種子。但是，這些經驗性的結論缺少足夠的科學試驗數據和統(tǒng)計分析支撐，因此，其區(qū)分雌雄大麻的準確率有待進一步驗證。

從重量差異角度考慮，在生產上，可使用風選式種子篩選機或重力篩選機對大麻種子進行分選，分選出的粒重飽滿者雌株比例高；從顏色差異角度考慮，可考慮色選，利用種子異色粒對特定光線的吸收或反射強度不同實現異色粒的分離，達到色選目的［11］。陳濤等［12］研究了棉花種子顏色分選自動化系統(tǒng)，可以有效區(qū)分黑色與紅棕色棉花種子。

2 大麻性別表達的影響因素

2.1 遺傳因素

大麻性別由異型染色體（X和Y）決定，雄性為XY，雌性為XX。MoliterniVMC等［13］對大麻的性分化進行形態(tài)學和分子的研究發(fā)現，當第4節(jié)的葉子出現時，大麻的生殖承諾可能會發(fā)生，在第4個節(jié)點的雄性和雌性存在差異表達。由此可見，工業(yè)大麻早期鑒定需在第4節(jié)葉子長出后進行，性別誘導應在第4節(jié)葉子長出前進行。Dole?elJ等［14］對雌雄異株植物的核DNA含量進行分析發(fā)現由于性別染色體異型性，雌性的DNA含量比雄性低。通過對大麻的DNA水平進行檢測，得到一條長約820 bp的與雌性性別連鎖的特異DNA片段［15］，若依據這些性別連鎖片段，通過轉基因等方式對其進行表型標記，培育出具有明顯辨別表型特性的大麻品種，則有利于實現雌雄植株的早期識別。

2.2 肥料對大麻性別表達的影響

大麻用肥主要為氮、磷、鉀及其他微量元素肥料，以及農家肥等。留種用大麻增施磷肥有利于提高種子產量和質量［16］。VanderWerf等［17］的研究表明，隨著氮肥施用量的增加，大麻雌株比例顯著增加。有人用8倍于克氏溶液的氮肥時，得到100%的雌株［18］。為了生殖生長需要，雌麻需要具有更強的生命力以抵抗各種生存壓力，在氮肥使用過多時誘導產生更多雌株。但是，氮肥促進營養(yǎng)生長，對生殖生長有抑制作用，在生產上采用高濃度氮肥誘導雌株的方法顯然不可取。磷肥具有促進開花結實，提升籽粒飽滿度的作用，可在作物進入生殖生長前增施磷肥提高種子產量。

2.3 激素誘導大麻性別分化

Chailakhyan MK［19］早在1937年就提出，性激素調控植物從營養(yǎng)生長到開花的轉變。隨著對各類植物激素研究的深入，其在促進生命活動，尤其是在性別表達中的作用逐漸被闡明。檢測激素和遺傳之間的相互作用機制及其在植物性別分化中的作用成為解決現代許多生物學難題的重要手段。細胞分裂素的作用表現在復制和翻譯水平，參與到tRNA與核糖體mRNA的復合；赤霉素表現在轉錄水平，通過誘導依賴細胞周期蛋白激酶基因的表達，促進細胞周期從G1期（DNA合成準備期）向S期（DNA合成期）轉變。Khryanin VN［20］研究發(fā)現赤霉素與莖伸長調節(jié)中幾個基因的關系，雌性植物組織中有一種特殊的細胞分裂素和一種特殊的蛋白，在雄性植物中卻不存在，且激素發(fā)揮作用的階段對植物的性別有很大影響。在許多草本植物中，花原基的發(fā)育及其性別分化與第3片葉片的發(fā)育是一致的。正因如此，在花分生組織形成后，植物激素對幼苗的處理并不能導致植株性別特征的改變［21］。這與Moliterni VMC［13］認為大麻在第4個節(jié)的雄性和雌性存在差異表達有相通之處。據Herich R等［22］的研究，大麻種子浸泡在赤霉素中24 h可以誘導更多的大麻雌株。乙烯則利能誘導大麻雄株產生雌花［23］。

2.4 重金屬鹽對大麻性別分化的影響

研究者使用重金屬鹽（Pb（NO3）2，CuSO4和ZnSO4）對大麻的植物激素狀態(tài)和性別表達進行研究，發(fā)現銅鹽和鋅鹽誘導植物雌性化，并且這種作用與玉米素積累相結合，鉛鹽有利于植物雄性化以及GA（赤霉素）積累。因此，植物性別表達的變化與重金屬對植物激素、GA和玉米蛋白平衡的作用有關［24］。以硝酸銀和硫磺酸銀的陰離子絡合物為原料，在遺傳雌性大麻植物中誘導出了不育的雄花［25］。

3 大麻性別的早期鑒定方法

3.1 形態(tài)學水平

通過植物形態(tài)特征鑒定植株性別，簡便易行，經濟高效。大麻幼苗期，可根據葉片形狀判斷雌雄。據谷雨田［9］觀察，雌株葉片短而寬，葉色深綠；雄株葉片長而尖，葉色淺綠。據此，可通過間苗期間苗來控制植株性別的比例，但水肥等其他因素會影響植株長勢，故有經驗的專業(yè)人員判斷更為準確。

3.2 生理代謝差異鑒別

研究［26］表明，雌雄株在氧化還原能力方面存在較顯著差異，雌性處于較還原狀態(tài)，而雄性處于相對氧化狀態(tài)，雌株幼葉較雄株有較多的過氧化物酶區(qū)帶。趙云云等［27］對銀杏雌雄株氨基酸組分及含量進行了研究，發(fā)現銀杏雌雄株的氨基酸平均含量有差異，雄株高于雌株，其中胱氨酸和酪氨酸含量較為突出。銀杏、楊梅、獼猴桃等樹種葉片水溶性酚類物質總量雌株普遍高于雄株，且差異達到極顯著水平［28］。該方法因無具體量化指標，且操作較為復雜，較難準確判斷植株性別。目前，在大麻性別鑒定方面尚未有相關研究，可以借鑒銀杏等植物的研究方法，對大麻雌雄株生理代謝進行深入研究。

3.3 化學物質分析鑒別

根據不同性別葉片對不同濃度化學試劑顯色不同，彭子模［29］使用0.1%甲基紅溶液對浸提幼葉的上清液進行染色，32℃水浴保溫，20 h后雌株出現明顯黃綠色，雄株為黃褐色。Andre C等［30］使用快藍B鹽對開花雌大麻的腺毛進行組織學觀察，顯微鏡下，清楚地顯示了包裹著乳劑的頭部的薄角質層，用快藍B鹽溶液處理，很容易觀察到淡紅色，結果還表明，該試劑在大麻雌株莖狀腺毛體中表現優(yōu)越。絞股藍苗期雌雄株鑒別則使用了0.1%BTB（溴麝香草酚藍）溶液，染色后10 h左右顏色有明顯差異，雌株的提取液為黃色，雄株為綠色。使用化學試劑染色鑒定植株性別，快速高效，且準確性較高，是雌雄異株植物性別鑒定的常用方法［31］。

3.4 DNA分子標記鑒別

特征序列擴增區(qū)域（SCAR），是從隨機擴增的多態(tài)性 DNA（RAPD）技術衍生而來，通過對RAPD片段克隆、測序、序列分析后設計出一對引物，互補到原來RAPD兩端的24堿基上［32］。用這對引物與原來的模板DNA進行PCR擴增，特征序列擴增區(qū)域被特異性擴增，結果穩(wěn)定可靠。采用SCAR標志物對大麻進行早期鑒定，用三甲基溴化十六烷基銨（CTAB）方法從中分離出DNA，使用MADC2（來自大麻的雄性相關DNA）引物作為標記來鑒定大麻的性別。利用MADC2－F和MADC2－R引物擴增基因組DNA，制備出兩個大小分別約為450 bp和300 bp的片段。在收獲用于脫氧核糖核酸外牽引的組織后，將花的外觀與DNA分析進行比較，分子分析結果與雄花或雌花的外觀一致。說明疤痕標記可以在非常早期鑒定大麻性別［33］。

4 對于大麻性別研究的展望

4.1 工業(yè)大麻種子無損鑒定

目前，在工業(yè)大麻種子性別無損鑒定方面的研究甚少，但水稻、玉米種子無損鑒定技術較為成熟。胡偉鳳等［34］使用色選機分選、色選與重力分選結合、色選與比重分選結合的方法研究了分選方式對雜交水稻種子活力的影響。在大麻種子分選及其性別鑒定中也同樣具有借鑒意義。鄧小琴等［35］采用融合光譜、紋理及形態(tài)特征的方法對水稻種子品種高光譜圖像單粒鑒別進行研究，實現了水稻品種的單?？焖勹b別。蘇謙等［36］采用近紅外光譜方法實現玉米品種的快速鑒定，并對不同品種的玉米種子建立了相應的鑒別模型。故可以考慮在對大麻種子進行去雜、清選、精選后，借鑒此類檢測技術實現工業(yè)大麻種子的無損鑒定，同時，加強對工業(yè)大麻種子顏色、紋理、形狀、光譜特性等方面的研究。

4.2 工業(yè)大麻無性繁殖

“中國草”苧麻在栽培中多采用扦插育苗。對工業(yè)大麻進行組織培養(yǎng)，獲得既定性別的無性繁殖后代，按需求進行雌雄株分開種植成為工業(yè)大麻發(fā)展的新方向。在人工快繁技術日新月異的今天，大麻無性快繁完全可以實現工業(yè)化生產，但是，扦插育苗的成本較種子直播高出數倍，降低扦插育苗成本是推廣應用的關鍵。故亟需配套的大麻幼苗栽培技術及大麻幼苗種植機械設備以減少勞動力成本。優(yōu)良種質、栽培技術與機械設備結合，才能更好推動工業(yè)大麻產業(yè)的發(fā)展。

4.3 工業(yè)大麻品種選育

工業(yè)大麻性別具有多樣性，生產上發(fā)現，雌雄同株品種表現良好且籽粒產量高，但遺傳極不穩(wěn)定，適應性較差。因此，希望選育出遺傳穩(wěn)定、適應性優(yōu)良的雌雄同株品種。但研究［37］認為，雌雄異株是大麻進化標志，雌雄同株是返祖遺傳（生物體偶然出現的與祖先相似性狀）。植物進化的方向是從雌雄同株進化為雌雄異株，雌雄同株大麻品種的育種是逆進化過程［38］。能否克服逆進化過程阻礙，嚴格隔離育種，獲得能夠穩(wěn)定遺傳、廣泛適應的雌雄同株品種成為今后工業(yè)大麻相關研究的又一挑戰(zhàn)。

4.4 工業(yè)大麻性別誘導技術

目前，對大麻性別誘導的研究主要在光周期、激素、化學試劑、重金屬鹽、肥料誘導等方面［39］。以上試驗證明上述因素確實可以誘導大麻性別分化，但是因各種誘導方法都會受到其他因素的干擾，作用效果不穩(wěn)定，目前還沒有形成可以在生產上廣泛使用的相關技術標準。因此，亟需深入研究各因素對大麻性別誘導的方法，形成規(guī)范完善的技術體系供生產使用。

4.5 工業(yè)大麻性別分子標記

利用大麻性別連鎖片段進行分子標記，通過轉基因等方式對其進行表型標記，培育出具有可以早期識別，有明顯辨別表型的大麻新品種。若能將性別連鎖片段在大麻子房壁細胞實現特異性標記，則有望實現通過種子顏色（紋理等）鑒定工業(yè)大麻性別。