腺葉桂櫻精油的抗氧化及抑菌活性研究

李敦禧 錢軍 黃丹慜 郭霞 田蜜 曾冬琴

摘 要 通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取腺葉桂櫻葉的精油，利用GC-MS分析了精油的化學(xué)成分，測(cè)定了精油中總多酚和總黃酮含量，并對(duì)精油的抗氧化活性，包括DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基及還原能力；以及利用生長(zhǎng)速率法測(cè)試精油的抑菌活性。結(jié)果表明：精油中主要成分為苯甲醛，含量為38.90%；精油中總多酚含量為8.60%，總黃酮含量為3.75%?？寡趸钚员砻?，精油對(duì)羥基自由基的清除活性較好，半清除率為7.548 mg/mL，與對(duì)照TBHQ活性相當(dāng)；DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性和還原作用則不如對(duì)照藥劑。抑菌活性表明，精油對(duì)芒果蒂腐病菌有較好的抑菌活性，抑制率為73.58%，與桉葉油活性相當(dāng)。由此推測(cè)，腺葉桂櫻精油可作為天然抗氧化劑和芒果保鮮劑的備選。

關(guān)鍵詞 腺葉桂櫻 ；精油 ；抗氧化活性 ；抑菌活性

中圖分類號(hào) Q949 ；R931.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.015

Abstract The essential oil was extracted from Laurocerasus phaeosticta leaves by hydrodistillation. The chemical composition of the essential oil was analyzed by GC-MS， and the total polyphenols and total flavonoids were determined. The antioxidant activities of the essential oil， including DPPH free radical， hydroxyl free radical and ABTS free radical and reducing power， were tested by using the mycelium growth method. The results showed that the main component of the essential oil was benzaldehyde with a content of 38.90%. The essential oil contained 8.60%t of total polyphenol and 3.75% of total flavonoids. The antioxidant activity test showed that the essential oil had better hydroxyl radical scavenging activity with an IC50 being 7.548 mg/ml， which was not different from that of the control TBHQ， and that the essential oil was lower in scavenging effect and reduction capacity of DPPH radical and ABTS radical than the control. The inhibitory activity showed that the essential oil had better antifungal activity against the pathogen of mango stem end rot （Botryodiplodia theobromae Pat）， with an inhibition of 73.58%， which was similar to that of the eucalyptus oil. The essential oil of L. phaeosticta could be used as a natural antioxidant and a preservative for storage of mango.

Keywords Laurocerasus phaeosticta ； essential oil ； antioxidant activities ； antifungal activities

腺葉桂櫻（Laurocerasus phaeosticta）屬薔薇科桂櫻屬（Laurocerasus）植物，別名為腺葉野櫻[1]。該植物分布在我國(guó)南部省份，如廣東、云南、海南等地。據(jù)報(bào)道，腺葉桂櫻為林下演替更新層樹種[2-3]，在海南楓木林場(chǎng)林下有較多分布。其它鮮見腺葉桂櫻的研究報(bào)道，但有關(guān)桂櫻屬植物在國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道。如利用桂櫻屬植物大葉桂櫻制作藥酒，用于治療月經(jīng)失調(diào)[4]、骨痛[5]等；Kupeli Akkol等[6]利用活性追蹤方法，從月桂櫻葉的乙醇提取物中，分離到2個(gè)糖苷類化合物，顯示出顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛活性。Liyana-Pathirana[7]發(fā)現(xiàn)，月桂櫻鮮果汁具有很強(qiáng)抗氧化作用，它有助于改善因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的退化性疾病。Guder等[8]發(fā)現(xiàn)，月桂櫻與黑莓一樣，具有很好的抗氧化活性，比化學(xué)合成的抗氧化劑活性好，由此，月桂櫻的果實(shí)在土耳其被廣泛食用。成分分析表明，桂櫻屬植物富含苯甲醛[9-10]、多酚和黃酮類[11-13]物質(zhì)。

根據(jù)文獻(xiàn)，桂櫻屬植物特別是月桂櫻得到深入的研究，而腺葉桂櫻研究報(bào)道較少。為此，本文以腺葉桂櫻為研究對(duì)象，通過(guò)水蒸氣蒸餾精油，并測(cè)試精油的總多酚和總黃酮含量，及其抗氧化活性和抑菌活性，期望為腺葉桂櫻精油的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

腺葉桂櫻（Laurocerasus phaeosticta）采自海南省楓木實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)（北緯19°12′15.57″，東經(jīng)109°57′38.71″），經(jīng)植物學(xué)專家鑒定。洗凈、晾干、粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.1.2 供試藥品

試劑：Folin-ciocalteu試劑，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），日本TCI公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），中國(guó)索萊寶公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品和蘆丁，上海麥克林生化科技有限公司；桉葉油，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）、過(guò)硫酸鉀等其他藥劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取腺葉桂櫻精油

取200 g腺葉桂櫻成熟的葉片，放入圓底燒瓶中，采用水蒸氣蒸餾法提取精油。保持油水混合物流出速度為1～2滴/s，直到流出物由混濁變透明為止，收集500 mL油水混合物，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，稱量精油質(zhì)量，根據(jù)下列公式計(jì)算精油的提取率。所得精油于4℃避光保存。

精油提取率（%）=精油質(zhì)量（g）×100/200（g）

1.2.2 腺葉桂櫻精油的GC-MS分析

用安捷倫7890B-7000B GC-MS技術(shù)對(duì)腺葉桂櫻精油進(jìn)行成分分析。色譜條件：安捷倫 HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 色譜柱，程序升溫：60 ℃（保留2 min），6℃/min升至300℃（保留20 min）；載氣：He，進(jìn)樣口溫度：250℃，分流進(jìn)樣比，20∶1，傳輸線溫度：280℃。質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓：70 eV，離子源溫度：250℃，掃描模式：全掃描，掃描范圍：20～450 aum，進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.2.3 腺葉桂櫻精油總多酚含量的測(cè)定

采用Folin-ciocalteu法[14]測(cè)定腺葉桂櫻精油總多酚的含量，用50%乙醇配制沒食子酸（GAE）標(biāo)準(zhǔn)溶液（96、64、32、16、8和4 μg/mL）和樣品溶液，取1 mL樣品溶液，加入0.5 mL Folin-ciocalteu試劑和4.5 mL超純水混勻，室溫下靜置5 min，然后加入1 mL 7.5 （w/V） 碳酸鈉溶液，室溫黑暗處理30 min，765 nm測(cè)定吸光度。50%乙醇作為陰性對(duì)照，沒食子酸作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總多酚含量（mg GAE/g，即每克樣品中總多酚的質(zhì)量數(shù)）。

1.2.4 腺葉桂櫻精油總黃酮含量的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定腺葉桂櫻精油總黃酮含量。用50%乙醇配制蘆丁（RE）標(biāo)準(zhǔn)溶液（96、64、32、16、8和4 μg/mL）和樣品溶液，在試管中，加入1 mL樣品溶液和4 mL超純水混合均勻，再加入0.3 mL 5% （V/w） 硝酸鈉溶液反應(yīng)6 min，接著加入0.3 mL 10%（V/w）氯化鋁溶液反應(yīng)6 min，加入2 mL 1M氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，最后用超純水定容10 mL，混勻后測(cè)定510 nm處吸光度，以50%乙醇溶液作為陰性對(duì)照，蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照，得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總黃酮含量（mg RE/g，即每克樣品中總黃酮質(zhì)量數(shù)）。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法，用95%乙醇配制20 mg/mL DPPH 母液，再稀釋成所需濃度使用。取0.5 mL 樣品液加入到3.5 mL DPPH 溶液中。黑暗處理30 min，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度A 值。陰性對(duì)照以同等體積的乙醇代替測(cè)試樣品；陽(yáng)性對(duì)照物選用蘆丁。每個(gè)濃度組平行測(cè)定3次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果以清除率（I）表示，計(jì)算公式為：

清除率I=（1-AS/A0）×100%

式中，AS—測(cè)試樣品的吸光度，nm；

A0—陰性對(duì)照的吸光度，nm。

1.2.6 羥基自由基清除能力測(cè)定

參照Fenton法[17]，取2.5 mL 濃度為2 mmol/L 的FeSO4溶液和2.5 mL 濃度為6 mmol/L的雙氧溶液，混勻后，加入7.5 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液，在37℃恒溫水浴中處理15 min，在510 nm 處的吸光度（As）。取4.0 mL不同濃度的精油樣品加入AO測(cè)定體系中，在37 ℃的恒溫水浴中處理15 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度（Ax）。以TBHQ為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。清除率計(jì)算公式：

清除率I=（1-AS/AO）×100%

1.2.7 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]的方法，配制ABTS溶液和過(guò)硫酸鉀溶液，黑暗反應(yīng)12～16 h，用95%乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光度為（0.7±0.02），黑暗密封保存?zhèn)溆?。?.1 mL不同濃度的精油樣品加入3.9 mL 上述ABTS自由基溶液，反應(yīng)6 min，在734 nm處測(cè)定吸光度As，0.1 mL 50%乙醇代替樣品測(cè)吸光度AO。每組試驗(yàn)平行重復(fù)3次。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率I=（1-AS/AO）×100%

1.2.8 Fe3+還原作用（FRAP）的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法，將0.1 mL的精油與3.0 mL FRAP溶液混合，37 ℃水浴5 min，取出后迅速混勻，測(cè)量混合液在593 nm的吸光度，F(xiàn)RAP溶液為25 mL醋酸鹽緩沖溶液（300 mM）、2.5 mL10 mM三吡啶三嗪的40 mM的鹽酸溶液和2.5 mL六水合三氯化鐵溶液（20 mM）混合，以50 %乙醇為陰性對(duì)照，七水合硫酸亞鐵為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定七水合硫酸亞鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)還原作用（mM Fe2+/g DW，即每克干燥樣品對(duì)高價(jià)鐵離子還原能力）。

1.2.9 腺葉桂櫻精油對(duì)果蔬病原真菌的抑菌活性測(cè)定

香蕉炭疽病菌（Calletotrichum musae），香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae）、火龍果黑斑病菌（Bipolaris cactivora），葡萄潰瘍病菌（Lasiodiplodia theobromae），番茄早疫病菌（Alternaria solani）由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

抑制活性采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[19]，用1.0%的吐溫80溶液配制濃度為1 000 μg/mL精油母液，取2 mL母液加入到18 mL 滅菌的PDA培養(yǎng)基中，形成100 μg/mL精油。在PDA平板中央放靶標(biāo)菌菌餅（ 5 mm），菌絲一面朝下，28 ℃培養(yǎng)。1.0%的吐溫80蒸餾水作為空白對(duì)照，相同濃度的桉葉油為藥劑對(duì)照。72 h后（芒果蒂腐病菌培養(yǎng)48 h），十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按照文獻(xiàn)[19]計(jì)算抑制率。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析法

采用Excel軟件對(duì)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以p<0.05為顯著差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 腺葉桂櫻精油的GC-MS分析

經(jīng)計(jì)算，水蒸氣蒸餾法獲得腺葉桂櫻精油的平均提取率為0.197%。精油的相對(duì)密度d為1.038 4，折光率n為1.502 1。將所得精油進(jìn)行GC-MS成分分析，得到總離子流圖（圖1）。對(duì)圖中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，并與NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，根據(jù)匹配鑒定出腺葉桂櫻精油中71種物質(zhì)的化學(xué)成分，部分化合物未能匹配鑒定；根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算出已鑒定的化合物在精油中的百分含量，結(jié)果見表1。

由表1可知，腺葉桂櫻精油中含有各種烷烴、醇、酚、醛、羧酸、酯、甾體等化合物。其中苯甲醛含量最高，為38.90%；其次是苯甲醇，含量為10.21%，植醇的含量為6.72%。其它大部分化合物的含量不足1%。由此表明，腺葉桂櫻精油中化合物的種類繁多，成分復(fù)雜。因而，腺葉桂櫻精油可能呈現(xiàn)出許多重要的生物及藥理活性。

2.2 腺葉桂櫻精油中總多酚和總黃酮的含量

根據(jù)沒食子酸測(cè)量結(jié)果，擬合出線性回歸方程Y=0.011 7X-0.017 9（R2=0.999 1），以回歸方程為參照，根據(jù)腺葉桂櫻精油測(cè)得的吸光度，計(jì)算出精油中總多酚的含量為85.99 mg GAE/g，即腺葉桂櫻精油中總多酚的含量為8.60%。

根據(jù)蘆丁測(cè)量結(jié)果，擬合出線性回歸方程為Y=0.002 4x-0.006 1（R2=0.999 6），根據(jù)腺葉桂櫻精油測(cè)量的吸光度，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算出精油中總黃酮的含量為37.53 mgRE/g，即腺葉桂櫻精油中總黃酮的含量為3.75%。

2.3 腺葉桂櫻精油對(duì)DPPH自由基清除作用

通過(guò)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基來(lái)測(cè)量精油的抗氧化活性，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著精油濃度不斷增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)精油的濃度為10 mg/mL時(shí)，自由基的清除率為55.98%，而蘆丁的濃度為32 μg/mL時(shí)，自由基的清除率為58.12%；根據(jù)精油和蘆丁的濃度、清除率，線性擬合出回歸方程，結(jié)果見表2。由表2可知，精油和蘆丁的半自由基清除率（IC50）分別為7.388和0.0252 mg/mL。通過(guò)比較IC50值，精油是蘆丁的293倍，由此表明，精油的抗氧化活性比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照蘆丁的活性差。

2.4 腺葉桂櫻精油對(duì)羥基自由基清除作用

根據(jù)Fenton方法，腺葉桂櫻精油對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)量結(jié)果如圖3所示。隨精油濃度增加，羥基自由基清除率不斷增加，且不同濃度之間清除率增加幅度較大。從2 mg/mL增加到4 mg/mL，清除率增加4.69倍，從4 mg/mL增加到6 mg/mL，清除率增加7.46倍。TBHQ從0.2 mg/mL增加到0.4 mg/mL，清除率增加11.76倍。由表2可知，腺葉桂櫻精油的半自由基清除率為7.548mg/mL，而TBHQ的半自由基清除率為0.443 6 mg/mL，精油的IC50值是TBHQ的17倍，根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，其抗氧化活性相當(dāng)。

2.5 腺葉桂櫻精油對(duì)ABTS自由基清除作用

根據(jù)ABTS的褪色原理，在734 nm處，測(cè)得腺葉桂櫻精油對(duì)ABTS自由基清除率結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨精油濃度不斷增加，ABTS自由基清除率逐漸增大，當(dāng)精油的濃度為6 mg/mL時(shí)，自由基的清除率為46.70%，而TBHQ的濃度為64 μg/mL時(shí)，自由基的清除率為47.52%，其自由基清除活性相當(dāng)。但是，精油的濃度是TBHQ的93.75倍；由表2可知，精油和TBHQ的半自由基清除率（IC50）分別為6.361和0.0710 mg/mL。精油的IC50值是TBHQ的89.59倍，其抗氧化活性不如標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

2.6 腺葉桂櫻精油的還原作用

以七水合硫酸亞鐵為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)測(cè)量精油不同濃度的吸光度來(lái)評(píng)價(jià)其還原作用，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著精油濃度不斷增加，在549 nm處，其吸光度慢慢增大，當(dāng)精油的濃度為10 mg/mL時(shí)，吸光度為0.486，而七水合硫酸亞鐵的濃度為16 μg/mL時(shí)，吸光度為0.5。由此表明，當(dāng)精油濃度為10 mg/mL時(shí)，與七水合硫酸亞鐵的濃度為16 μg/mL時(shí)的還原作用相當(dāng)，但是精油濃度是陽(yáng)性對(duì)照的625倍；因此，精油的還原作用比七水合硫酸亞鐵的還原作用差。

2.7 腺葉桂櫻精油的抑菌作用

以桉葉油為對(duì)照藥劑，利用生長(zhǎng)速率法，測(cè)試腺葉桂櫻精油對(duì)6種靶標(biāo)真菌的抑菌活性，結(jié)果見圖6。在質(zhì)量濃度為100 μg/mL下，精油對(duì)6種靶標(biāo)菌的菌絲生長(zhǎng)有較好的抑制活性，特別是對(duì)芒果蒂腐病菌，抑制率為73.58%；與對(duì)照藥劑桉葉油（79.65%）無(wú)顯著性差異。對(duì)番茄早疫病菌和火龍果黑斑病菌，其精油抑制率分別為55.28%、34.47%，與對(duì)照藥劑桉葉油（57.78%、38.42%）也無(wú)顯著性差異。對(duì)其它病菌的抑制率與對(duì)照藥劑間存在顯著性差異，尤其是對(duì)香蕉枯萎病菌，精油的抑制率僅為9.79%，而桉葉油的抑制率達(dá)到30.90%。由此表明，精油有較好的抑菌活性，但從廣譜抑菌活性來(lái)看，精油的活性比桉葉油活性稍差。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)水蒸氣蒸餾，從腺葉桂櫻中獲得精油含量為0.197%，比同屬植物大葉桂櫻中的精油（0.15%）含量略高[9]。GC-MS分析比較，月桂櫻精油中苯甲醛含量最高，為99.7%[10]；大葉桂櫻精油中苯甲醛含量為44.46%[9]；腺葉桂櫻精油中最高含量也是苯甲醛，含量為38.90%。初步推斷，苯甲醛為桂櫻屬精油的主要成分；但是大葉桂櫻僅檢測(cè)出10個(gè)成分，而腺葉桂櫻精油中被檢出71個(gè)成分?？赡茉蚴?，現(xiàn)在的設(shè)備較以前更加先進(jìn)，色譜柱更加精密，數(shù)據(jù)庫(kù)更加豐富，從而檢測(cè)出的成分更多。

該精油中，總多酚含量為8.60%，總黃酮含量為3.75%。根據(jù)GC-MS分析，酚的含量合計(jì)為6.38%，少于總多酚含量?？赡苁欠椒ú灰粯?，總多酚采用Folin-ciocalteu法，利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；而采用GC-MS檢測(cè)，除直接檢測(cè)到酚類物質(zhì)，還用酚的衍生物，這類物質(zhì)在總多酚檢測(cè)中，可能都被檢測(cè)，最終總多酚含量顯示較高。黃酮的含量有類似總多酚的情況。Karahalil等[11]測(cè)定月桂櫻果實(shí)中總多酚和總黃酮分別為10.94 mg GAE/g DW和0. 80 mg QUE/g DW；Ozturk等[13]測(cè)量貯藏期月桂櫻果實(shí)的總多酚為9.44 mg GAE/g 和總黃酮0.12 mg QE/g，都比本文測(cè)量得到的總多酚總黃酮含量少；而Karabegovic等[12]發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同地域的植物材料，總多酚從36.2 到119.4 mg GAE/g，總黃酮12.9到66.6 mg RE/g，該結(jié)果正好涵蓋本文測(cè)量的數(shù)據(jù)。

抗氧化活性表明，腺葉桂櫻精油有較好的抗氧化活性，特別是對(duì)羥基自由基的清除活性，與對(duì)照TBHQ活性相當(dāng)，但是DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性不如對(duì)照，總還原活性也比對(duì)照活性差。從文獻(xiàn)情況來(lái)看，不同地方的月桂櫻，其抗氧化活性存在顯著性差異[20]；且抗氧化活性隨時(shí)間延長(zhǎng)，活性逐漸降低[13]。由此表明，桂櫻屬植物具有抗氧化活性，不同植物抗氧化活性可能存在一定差異。另外對(duì)照樣品為專用化學(xué)抗氧化劑，而精油來(lái)自植物，屬于天然抗氧化劑類別，因此，具有一定利用價(jià)值。

抑菌活性發(fā)現(xiàn)，腺葉桂櫻精油對(duì)不同靶標(biāo)真菌具有顯著性差異，對(duì)芒果蒂腐病菌有較好的抑菌活性，與對(duì)照藥劑活性相當(dāng)；對(duì)其它病菌活性不理想。由于芒果蒂腐病菌生長(zhǎng)速度快，2 d內(nèi)直徑可達(dá)5 cm左右，而精油的使用，在速效上抑制了該菌的快速生長(zhǎng)，所以表現(xiàn)出較好的抑菌活性。其它病菌生長(zhǎng)速度較慢，精油的速效性很難發(fā)揮作用，所以抑菌活性不理想。由此表明，對(duì)容易快速引起植物或果實(shí)發(fā)病的病原菌，可以使用精油進(jìn)行前期處理，以便延緩病菌的擴(kuò)展速度，輔助化學(xué)殺菌劑，這樣將會(huì)有好的防治效果，同時(shí)能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量，達(dá)到減藥的目的。

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