缺氧條件下乳腺癌細胞γ—分泌酶對Notch信號通路影響

蔣宏

[摘要] 目的 探討缺氧條件下乳腺癌細胞γ-分泌酶對Notch信號通路的影響。方法 研究該院于2015年4月—2016年4月期間收治的MCF-7乳腺癌患者，將MCF-7乳腺癌患者細胞分為缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組和常規(guī)組，常規(guī)組加入磷酸鹽緩沖液作為對照，缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組則分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。24 h后檢測3組樣本NICD陽性率，采用Transwell侵襲實驗檢測并比較3組細胞侵襲能力。結果 常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細胞中NICD陽性率分別為71%、83%和90%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；缺氧Ⅱ組（265.62±12.68）MCF-7細胞穿過基質膜的細胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之（166.59±11.46），常規(guī)組最少（76.72±9.84），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=165.306，P<0.05）。 結論 缺氧環(huán)境下明顯提高NICD的陽性表達，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信號通路越強，MCF-7細胞侵襲和轉移能力越強。

[關鍵詞] 乳腺癌；缺氧；γ-分泌酶；Notch信號通路；影響

[中圖分類號] R614 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）06（b）-0026-03

Effect of Gamma Secretase on Notch Signaling Pathway in Human Breast Cancer Cells under Hypoxia

JIANG Hong

Department of Colorectal Anus Surgery， Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256600 China

[Abstract] Objective To investigate the effect of γ -secretase on Notch signal pathway in breast cancer cells under hypoxia. Methods The patients with MCF-7 breast cancer admitted and treated in our hospital from April 2015 to April 2016 were selected and divided into three groups， including hypoxia I group， hypoxia II group and routine group， and the routine group added the phosphate buffer for control， and the hypoxia I group and hypoxia II group respectively used the 50 μmol/ L and 100 μmol/ L concentrations of cobalt dioxide for treatment， and were cultured for 24 h in the couveuse at 37℃， 5%CO2， and the positive rate of NICD of the three groups was tested after 24 h， and the invasion capabilities of cells of the three groups were tested and compared by the Transwell invasion experiment. Results The NICD positive rates of breast cancer cells in the routine group， hypoxia I group and hypoxia II group were respectively 71%， 83%， 90%， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）， and the total number of MCF-7 cell through basal plasmamembrane in the hypoxia II group was the most， then the hypoxia I group and routine group， [（ 265.62±12.68） ， （166.59±11.46） ， （76.72±9.84）]， and the difference was statistically significant（F=165.306，P<0.05）. Conclusion The NICD positive expression is obviously improved under hypoxia， and the higher the hypoxia degree， the higher the activity of gamma secretase， and the stronger the Notch signal pathway and MCF-7 cell invasion and metastasis abilities.

[Key words] Breast cancer； Hypoxia； γ-secretase； Notch signal pathway； Effect

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，已成為威脅婦女健康的主要病因，并已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題[1]。目前，乳腺癌的治療仍然依靠傳統(tǒng)的化療，其深受頻繁的治療失敗和耐藥的困擾，因此尋找新的研究靶點、為腫瘤靶向治療提供新思路無疑具有十分重要的意義。Notch信號途徑是一種進化保守的傳導信號通路，Notch信號蛋白在多種生物體內(nèi)均有表達，主要介導細胞的分化抑制信號，是決定細胞命運的信號通路[2]，研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在乳腺癌的浸潤和轉移中起著不可或缺的作用[3]。而γ-分泌酶是Notch信號蛋白活化過程中第二步水解的必需酶，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關系。此外，低氧腫瘤微環(huán)境通過激活基因增加癌癥細胞運動和腫瘤細胞外基質降解，從而介導腫瘤的浸潤，缺氧可使上皮細胞失去附著功能，并獲得能遷徙的間質表型，所以有理由認為缺氧誘導可導致乳腺癌耐藥及轉移，但其機制尚未完全明確[4]。為進一步探討缺氧條件下乳腺癌細胞γ-分泌酶對Notch信號通路的影響，進行了該項實驗研究，對該院于2015年4月—2016年4月期間收治的MCF-7乳腺癌患者進行分析，以期為乳腺癌治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

乳腺癌MCF-7細胞系（美國ATCC公司）、RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Gibco公司）、二氧化鈷（美國Sigma公司）、4%多聚甲醛固定液（北京Solarbio科技有限公司）、FuGENE HD轉染試劑（美國羅氏公司）、Transwell小室（美國康寧生物科技公司）、一抗兔抗人NICD（密理博公司 Millipore，Cat：07-1232，工作濃度1∶100），二抗即用型試劑盒（PV6001、PV9001）及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCF-7細胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基。以4×105個/孔采用6孔板進行接種，常規(guī)組加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）作為對照，缺氧Ⅰ組、缺氧Ⅱ組則分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。24 h后以細胞貼壁融合達80%作為開始傳染的標準，傳染嚴格按照試劑使用說明書進行操作，完成后于培養(yǎng)基中孵育10 min。

1.2.2 免疫組化 采用SP二步法免疫組化染色，實驗步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。結果以陽性細胞所占百分比表示，即低倍鏡下（40倍）隨機選取10個視野，分別計數(shù)100個細胞，取均值，以胞核或胞漿呈棕黃、棕褐色為判斷陽性標準[5]。無染色或陽性率不足1%以（-）表示，陽性率1%～20%以（+）表示，21%～40%以（++）表示，40%以上以（+++）表示，陽性率≥21%記為陽性表達。

1.2.3 MCF-7侵襲能力實驗 將上室未轉移的細胞和基質膠去除，切下聚碳酸酯膜，浸入4%多聚甲醛液中固定30 min，PBS溶液清洗3次，常規(guī)蘇木素染色，中性樹膠封片。顯微鏡（100倍）下計數(shù)移至微孔膜下層的細胞。每組樣本隨機計數(shù)5個視野，以穿過基質膜的細胞總數(shù)表示乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力，計算出平均值，每組重復試驗3次。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，樣本率間比較用χ2檢驗，計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，各組細胞穿透基底膜數(shù)量比較均采用單因素方差分析（Analysis of single variance，ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組樣本NICD陽性率比較

結果顯示，常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細胞中NICD陽性率分別為71%、83%和90%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 3組樣本MCF-7細胞穿過基質膜的細胞總數(shù)

結果顯示，缺氧Ⅱ組MCF-7細胞穿過基質膜的細胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之，常規(guī)組最少，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物阿霉素和多西紫杉醇在乳腺癌治療中耐藥性的產(chǎn)生在某些情況下可以歸因于Notch信號通路與Akt途徑的串擾[6]。Notch信號途徑是一種進化保守的傳導信號通路，Notch信號蛋白在多種生物體內(nèi)均有表達，其成員的結構具有高度的保守性；并在多種細胞分化、生物發(fā)育的過程中發(fā)揮著至關重要的作用[7]。Notch信號蛋白主要介導細胞的分化抑制信號，是決定細胞命運的信號通路，同時也是維持干細胞增殖能力的信號通路。Notch信號通路不單影響細胞的分化、發(fā)育及凋亡，而且與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關[8]。Notch的活化是通過啟動Notch配體（Jagged/Serrate家族）結合Notch受體（Notch1-4），之后通過TACE和γ-分泌酶相繼水解，釋放Notch細胞內(nèi)結構域（NICD）影響核轉錄。γ-分泌酶是一種包括PS二聚體、Nicastrin、Aph-1、PEN-2 等組分的多酶復合體，是Notch信號蛋白活化過程中第二步水解的必需酶，能夠促使受體蛋白胞內(nèi)段的釋放，胞內(nèi)段進入細胞核后與轉錄因子CBF-1相結合而產(chǎn)生一系列的生物學效應[9]。

該研究中缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組分別以50 μmol/L和100 μmol/L濃度的二氧化鈷處理，結果顯示，常規(guī)組、缺氧Ⅰ組和缺氧Ⅱ組MCF-7乳腺癌細胞中NICD陽性率分別為71%、83%和90%；并且缺氧Ⅱ組MCF-7細胞穿過基質膜的細胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之，常規(guī)組最少。缺氧Ⅱ組（265.62±12.68）MCF-7細胞穿過基質膜的細胞總數(shù)最多，缺氧Ⅰ組次之（166.59±11.46），常規(guī)組最少（76.72±9.84），組間差異有統(tǒng)計學意義（F=165.306，P<0.05）國外研究已證實γ-分泌酶抑制劑阻斷癌細胞中的Notch信號后，癌細胞的生長受到明顯抑制。由于γ-分泌酶在調節(jié)NICD釋放中起到關鍵作用，所以，觀察缺氧條件下NICD的變化可反映γ-分泌酶的活性，進而反映Notch信號通路的表達狀態(tài)。同時在，周敏等[10]專家的研究中，證實Notch～4各亞型在A549細胞中均有一定的表達，5、10、20 μmol/L。MW167處理肺腺癌A549細胞2 d后，加藥組以及對照組對比，NotchL水平呈現(xiàn)為升高的趨勢，組間對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；細胞繁殖率也相應上升（r=0.904）。

綜上所述，缺氧環(huán)境下明顯提高NICD的陽性表達，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信號通路越強，MCF-7細胞侵襲和轉移能力越強。

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（收稿日期：2018-03-18）