PCR與RFLP方法快速診斷細(xì)菌感染的應(yīng)用與臨床價(jià)值分析

邵華

[摘要] 目的 分析細(xì)菌感染診斷中應(yīng)用PCR與RFLP方法快速診斷的價(jià)值。 方法 將已知菌7株與2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫(yī)院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標(biāo)本作為研究對(duì)象，均進(jìn)行PCR與RFLP方法快速診斷，將快速診斷結(jié)果與臨床診斷進(jìn)行比較。 結(jié)果 PCR診斷已知菌陽(yáng)性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片片段長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.004 8、2.005 1、3.011 6、3.045 2，P>0.05）。結(jié)論 相比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法診斷細(xì)菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，可以明顯縮短診斷時(shí)間，可直接鑒定臨床標(biāo)本，值得借鑒。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)菌感染；生殖道炎癥；PCR；RFLP；價(jià)值；分析

[中圖分類(lèi)號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）06（b）-0014-03

Analysis of Application of PCT and RFLP Method in Rapid Diagnosis of Bacterial Infection and Its Clinical Value

SHAO Hua

Department of Clinical Laboratory， People's Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone & Linyi Third Peoples Hospital， Linyi， Shandong Province， 276000 China

[Abstract] Objective To analyze the application of PCT and RFLP method in rapid diagnosis of bacterial infection and its clinical value. Methods 7 strains of know bacterial and 35 cases of patients with inflammatory lesions of the genital tract confirmed by our hospital from January 2013 to December 2017 were selected as the research objects for PCR and RFLP rapid diagnosis， and the rapid diagnosis results and clinical diagnosis results were compared. Results The positive rate of known bacterial diagnosed by PCR， and positive rate of PFLP diagnosis were respectively 85.71%（6/7） and 100.00%， and the fragment length of the PCR amplified products of the known bacteria was basically consistent with the results of RFLP electron cloning， the difference was not statistically significant（χ2=1.004 8， 2.005 1， 3.011 6， 3.045 2， P>0.05）. Conclusion The PCR and RFLP rapid diagnosis is rapid， sensitive and accurate compared with the traditional germiculture in diagnosis bacterial infection， which can obviously shorten the diagnosis time and directly identify the clinical specimens， and it is worth reference.

[Key words] Bacterial infection； Inflammation of the genital tract； PCR； RFLP； Value； Analysis

生殖道炎癥屬于比較常見(jiàn)的多發(fā)性疾病，這種疾病多因細(xì)菌感染所致，盡早診斷與治療是防治關(guān)鍵。微生物感染常用的診斷方式為分離培養(yǎng)及鑒定，盡管準(zhǔn)確率高，但其比較耗時(shí)，方法也相當(dāng)繁瑣[1-3]。為了探討這種快速方法診斷細(xì)菌感染的價(jià)值，該文就2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫(yī)院收治的35例經(jīng)臨床確診的生殖道炎癥疾病患者與已知菌7株實(shí)施了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將已知菌7株與臨沂市第三人民醫(yī)院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標(biāo)本作為研究對(duì)象，患者均為該院收治的陰道炎與宮頸炎患者，年齡20～67歲，均值（45.9±5.4）歲；陰道炎23例、宮頸炎12例。此外，入選對(duì)象和（或）家屬簽署知情同意書(shū)愿意配合研究，且該研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 菌株類(lèi)型 共計(jì)7株菌株類(lèi)型，為該市某醫(yī)院微生物室保存及提供，包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌及衣氏放線菌。

1.2.2 標(biāo)本提供 包括人白細(xì)胞DNA、白假絲酵母菌DNA及HBV-DNA陽(yáng)性血清標(biāo)本，均由上述醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2.3 主要的試劑及相關(guān)的儀器 該次研究中涉及的試劑與儀器如下：PCR反應(yīng)試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶Hae Ⅲ、HBV DNA提取試劑盒、酶切緩沖液10×M Buffer（2 μL）、酶切位點(diǎn)、毛細(xì)管（45×50 μm）、去離子甲酰胺、POP-Polymen、GeneScan 500ROX、瓊脂糖、PCR熱循環(huán)儀、凝膠成像儀、Mupid電泳儀等。

1.2.4 細(xì)菌培養(yǎng) 所有患者均采取生殖道標(biāo)本，以棉拭子從生殖道獲取標(biāo)本，接種在瓊脂培養(yǎng)基與巧克力瓊脂培養(yǎng)基，以及伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、淋病奈瑟菌培養(yǎng)基中，溫度為37℃，時(shí)間18～24 h。

1.2.5 熒光標(biāo)記引物 熒光標(biāo)記引物采取合成16SrRNA基因序列引物，其中序列情況如下：①上游引物：5（FAM）-ACACTGGAACTGAGACACGG-3；②下游引物：5–CTCTACGCATTTCACCGCTAC-3。

1.2.6 PCR模板制備 ①標(biāo)本PCR模板：從宮頸或陰道用拭子取標(biāo)本1.5 mL放于無(wú)菌離心管，加1 mL無(wú)菌水，反復(fù)振蕩混懸后將拭子棄去，以1 500 r/min離心5 min，取0.5 mL上清液，然后繼續(xù)以15 000 r/min離心10 min，棄去上清液后以無(wú)菌水進(jìn)行洗滌沉淀，反復(fù)操作3次，每次離心速率為15 000 r/min、時(shí)間為10 min，最終取15 μL沉淀加0.2 mL微量離心管，99℃裂解10 min后浸入冰浴待用。②已知菌PCR模板：收集培養(yǎng)的細(xì)菌，用無(wú)菌水配制0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海?5 μL加微量離心管后，裂解后置入冰浴待用。

1.2.7 PCR擴(kuò)增 取dNTP混合物4 μL、10×ExTaq Buffer 5 μL、引物1與引物2各2 μL，以及15 μL模板、0.25 μL的1.25 U TaKaRa Ex Taq及無(wú)菌水，控制總體積50 μL，PCR擴(kuò)增時(shí)將反應(yīng)體系管置入離心機(jī)中，以3 000 r/min離心速率處理30 s，置入PCR熱循環(huán)儀中擴(kuò)增，反應(yīng)的條件包括預(yù)變性94℃ 1 min、變性98℃ 15 s、退火55℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共計(jì)30周循環(huán)，之后置入4℃保存待檢。

1.2.8 酶切 取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，加入2 μL buffer、1 μL Hae Ⅲ及15 μL無(wú)菌水，37℃孵育1 h，置入-20℃冷凍保存。

1.2.9 RFLP分析 將酶切產(chǎn)物1 μL和24 μL去離子甲酰胺與1 μL ROX混勻后，95℃變性2 min，快速冰浴冷卻，實(shí)施RFLP分析，其中電壓15 kV、電流12 μA、溫度60℃、功率9.9 mW、時(shí)間25 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

該次研究數(shù)據(jù)采取SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采取χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 已知菌PCR及RFLP診斷結(jié)果情況

PCR診斷已知菌，其中陽(yáng)性有大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌6種，而衣氏放線菌為陰性，陽(yáng)性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷為100.00%。

2.2 已知菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR與RFLP結(jié)果

已知菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片片段長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

生殖道感染屬于常見(jiàn)疾病，多為細(xì)菌感染所致，在女性中除了會(huì)造成盆腔炎與不孕不育等，還可能導(dǎo)致性傳播疾病、新生兒先天性疾病等[4-6]，為此盡早明確診斷與處理十分必要。傳統(tǒng)診斷方式為分離培養(yǎng)法，被公認(rèn)為金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢、無(wú)法人工培養(yǎng)及條件苛刻等情況下的標(biāo)本不宜采用[7-11]，為此需尋求一種準(zhǔn)確、快速的診斷方式。

在該次研究中顯示PCR診斷已知菌陽(yáng)性率為85.71%（6/7），生殖道炎癥標(biāo)本陽(yáng)性率為82.86%（29/35），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片片段長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RFLP電子克隆結(jié)果基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。該研究結(jié)果與同類(lèi)研究相似，李琳等學(xué)者[12]采取16S rRNA集技術(shù)對(duì)已知菌8株、生殖道炎癥標(biāo)本及其培養(yǎng)物38例進(jìn)行PCR擴(kuò)增與限制性?xún)?nèi)切酶處理，并予以RFLP鑒定不同病原菌，結(jié)果顯示已知菌擴(kuò)增陽(yáng)性率為75%，生殖道感染標(biāo)本PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率則為79%，RFLP陽(yáng)性率均為100%；已知菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物5端HaeⅢ完全酶切片段的RFLP結(jié)果和電子克隆產(chǎn)物酶切片段基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PCR與RFLP快速診斷方法能將細(xì)菌鑒定到種，測(cè)定時(shí)間不超過(guò)24 h，單份標(biāo)本能單獨(dú)測(cè)定[13-16]，而且實(shí)際操作中不做酶切者當(dāng)日便可檢出結(jié)果，需酶切者次日也可獲取檢測(cè)結(jié)果，這種方法對(duì)象為細(xì)菌核酸，和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，靈敏度更高，耗時(shí)更短，使得假陰性結(jié)果更少，在各類(lèi)細(xì)菌感染中均可快速明確診斷[17-20]。

綜上所述，相比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法診斷細(xì)菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，可以明顯縮短診斷時(shí)間，可直接鑒定臨床標(biāo)本，值得借鑒。

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（收稿日期：2018-03-15）