晚期氧化蛋白產(chǎn)物通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)人腎小管上皮細(xì)胞自噬的研究??

李敏暉，湯 珣，姜婷婷，張?chǎng)┯?，謝 唯，章 俊△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院血液凈化中心，廣東佛山 528244；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州 510280)

晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPPs)是一類尿毒癥毒素，近年來(lái)，大量證據(jù)表明其與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細(xì)胞損傷的早期應(yīng)激事件。本課題組在新近的研究中發(fā)現(xiàn)，AOPPs可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)發(fā)生ERS[2]。但AOPPs是否可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞出現(xiàn)代謝活性降低等其他損傷改變尚未十分明確。自噬是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種溶酶體依賴的降解途徑[3]。本課題組前期研究表明AOPPs能抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性，而其具體機(jī)制仍有待闡述[4]。ERS和自噬之間的直接聯(lián)系在近年被相繼報(bào)道。但是AOPPs誘導(dǎo)的ERS與自噬活性降低之間是否存在聯(lián)系及其具體關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不清楚。本文主要探討AOPPs誘導(dǎo)的ERS是否介導(dǎo)了自噬活性降低的過(guò)程及其機(jī)制，旨在進(jìn)一步闡明HK-2細(xì)胞在應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激時(shí)內(nèi)環(huán)境與代謝活性改變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 HK-2細(xì)胞株[(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)]；無(wú)內(nèi)毒素牛血清清蛋白(BSA，美國(guó)Sigma公司)；次氯酸(美國(guó)Gibco公司)；ERS激活劑Thapsigargin(美國(guó)Sigma公司)、ERS抑制劑Salubrinal及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制劑Compoun C(美國(guó)MedChem Express公司)、AMPK激活劑AICAR(美國(guó)Selleck公司)；磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、Beclin1、p62、LC3、CHOP兔抗人一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)兔抗人一抗(中國(guó)Proteintech公司)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1體外制備AOPPs 將不含游離氨基酸、碳水化合物、脂類成分的BSA與200 mmol/L次氯酸按1∶140混合，室溫避光慢搖30 min，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中4 ℃透析24 h以除去游離的次氯酸，并用Detoxi-Gel柱去除內(nèi)毒素。通過(guò)測(cè)定340 nm處的吸光度值估算AOPPs含量，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)取得，內(nèi)毒素含量低于0.025 EU/mL。

1.2.2HK-2細(xì)胞的培養(yǎng) 將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，胰酶消化后接種于培養(yǎng)皿或6孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后換為含2% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基使細(xì)胞同步生長(zhǎng)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 (1)為明確AOPPs對(duì)HK-2細(xì)胞AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響，將細(xì)胞分為3組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h。(2)為明確AMPK/mTOR信號(hào)通路在AOPPs影響自噬活性中的作用，將細(xì)胞分為5組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h；④Compoun C(AMPK阻斷劑)組：1 mmol/L Compoun C處理細(xì)胞48 h；⑤AICAR(AMPK激活劑)組：AICAR 5 mmol/L預(yù)處理1 h后，給予200 μg/mL AOPPs作用48 h。(3)為明確ERS介導(dǎo)AOPPs對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響及其機(jī)制，將細(xì)胞分為5組：①正常組；②BSA組：200 μg/mL BSA作用48 h；③AOPPs組：200 μg/mL AOPPs作用48 h；④Thapsigargin(ERS激活劑)組(Tag組)：0.25 μmol/L Thapsigargin處理細(xì)胞48 h；⑤Salubrinal(ERS阻斷劑)組(Sal組)：50 μmol/L Salubrinal預(yù)處理1 h后，給予200 μg/mL AOPPs作用48 h。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法同1.2.3，作用48 h后，RIPA裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，隨后采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶粉或BSA封閉1 h后，在一抗中4 ℃孵育過(guò)夜。吸棄一抗，TBST洗膜，每次10 min，共3次，然后在二抗中室溫孵育1 h。TBST洗膜，每次10 min，共3次，隨后室溫下ECL顯色。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1AOPPs對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響 根據(jù)前期研究，將未經(jīng)修飾的BSA(200 μg/mL)和AOPPs(200 μg/mL)分別刺激HK-2細(xì)胞48 h。Western blot結(jié)果顯示，與正常組及BSA組相比，AOPPs可抑制AMPK的磷酸化和誘導(dǎo)mTOR的磷酸化，激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白Western blot條帶；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達(dá)分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達(dá)分析圖；*：P<0.05，與正常組比較;1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組圖1 AOPPs激活HK-2細(xì)胞的AMPK/mTOR信號(hào)通路

2.2AMPK/mTOR信號(hào)通路在AOPPs對(duì)HK-2細(xì)胞自噬活性影響中的作用 分別加入AMPK的特異性阻斷劑Compoun C和激活劑AICAR處理HK-2細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin1和p62，以及AMPK、mTOR的磷酸化水平。結(jié)果顯示：Compoun C單獨(dú)處理細(xì)胞后，表現(xiàn)出與AOPPs相似的效應(yīng)，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換減少，Beclin1表達(dá)下降，p62表達(dá)上升，同時(shí)抑制AMPK的磷酸化，增加mTOR的磷酸化；而AMPK激活劑AICAR與AOPPs共同作用于HK-2細(xì)胞后，可部分逆轉(zhuǎn)AOPPs的作用，表現(xiàn)為激活A(yù)OPPs抑制的AMPK的磷酸化及抑制AOPPs誘導(dǎo)的mTOR的磷酸化，同時(shí)能使自噬活性升高，即LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換增加，Beclin1上調(diào)，而p62表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。

圖2 自噬標(biāo)志物蛋白Western blot條帶

A：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達(dá)分析圖；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達(dá)分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達(dá)分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較;1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組；4：Compoun C組；5:AICAR組圖3 AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)AOPPs抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性

2.3ERS對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響 為了明確ERS在AOPPs調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路中的作用，本研究予ERS激動(dòng)劑Thapsigargin及抑制劑Salubrinal分別處理HK-2細(xì)胞48 h，檢測(cè)ERS激活的標(biāo)志性蛋白GRP78、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，加入Salubrinal后，AOPPs抑制AMPK的磷酸化和誘導(dǎo)mTOR的磷酸化效應(yīng)可被部分逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為AMPK磷酸化增加，mTOR磷酸化降低，而Thapsigargin能抑制AMPK的磷酸化，同時(shí)誘導(dǎo)mTOR的磷酸化，激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路，與AOPPs作用相似(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

圖4 ERS激活的標(biāo)志性蛋白Western blot條帶

A：GRP78蛋白表達(dá)分析圖；B：p-AMPK與AMPK蛋白表達(dá)分析圖；C：p-mTOR與mTOR蛋白表達(dá)分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較；1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組;4：Tag組；5：Sal組圖5 ERS參與AOPPs激活HK-2細(xì)胞AMPK/mTOR信號(hào)通路的過(guò)程

2.4ERS、AMPK/mTOR信號(hào)通路與自噬活性的關(guān)系 分別采用ERS抑制劑Salubrinal和激活劑Thapsigargin處理HK-2細(xì)胞，檢測(cè)自噬標(biāo)志物的蛋白水平。結(jié)果顯示：加入ERS激活劑后，LC3Ⅱ及Beclin1降低，p62升高，即自噬活性降低。而AOPPs與ERS抑制劑共同作用于細(xì)胞后，AOPPs抑制的自噬被部分逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3Ⅱ和Beclin1升高，p62降低，即自噬水平上升(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

A：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白Western blot條帶；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達(dá)分析圖；*：P<0.05，與正常組比較；#：P<0.05，與AOPPs組比較；1：正常組；2：BSA組；3：AOPPs組;4：Tag組；5：Sall組圖6 ERS通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)AOPPs誘導(dǎo)的自噬抑制

3 討 論

腎臟纖維化是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展至終末期腎臟病的共同通路，近年來(lái)研究表明，腎小管間質(zhì)病變程度與腎功能關(guān)系較腎小球病變更為密切[5]。大量研究表明，自噬與多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，如足細(xì)胞病[6]、糖尿病腎病[7]、急性腎缺血-再灌注損傷[8]等。有研究表明，糖尿病腎病中腎小管上皮細(xì)胞自噬活性降低[9]，而自噬活性上調(diào)可抵抗多種物質(zhì)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，如尿蛋白[10]和糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[11]等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AOPPs可降低HK-2細(xì)胞的自噬活性[4]，但是其誘導(dǎo)機(jī)制尚未明確。

近年來(lái)，大量證據(jù)表明AOPPs與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。本課題組前期已經(jīng)證明了AOPPs可通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性[4]。在此，本研究證明了AMPK/mTOR信號(hào)途徑可能參與了AOPPs誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬抑制的過(guò)程。主要依據(jù)如下：(1)本實(shí)驗(yàn)顯示，AOPPs可抑制AMPK的磷酸化和誘導(dǎo)mTOR的磷酸化，提示AOPPs可激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路。(2)AOPPs和AMPK蛋白抑制劑Compoun C均能抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性，而AMPK激活劑AICAR能增加HK-2細(xì)胞的自噬活性。既往研究表明，AGEs能抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性[11]，本課題組前期研究也表明，與AGEs同屬代謝產(chǎn)物的AOPPs也能抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性[4]，本研究更是首次提出了AMPK/mTOR信號(hào)通路的激活介導(dǎo)了AOPPs誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬活性降低的過(guò)程。

在氧化應(yīng)激的病理?xiàng)l件下，AMPK激活能增加ATP生成并減少ATP消耗，維持機(jī)體能量平衡[12]，而氧化應(yīng)激與ERS又密切相關(guān)[13]。故本研究繼續(xù)探討在AOPPs誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生自噬活性抑制的過(guò)程中，AMPK/mTOR信號(hào)通路與ERS在其中的關(guān)系。本研究結(jié)果提示，在AOPPs抑制HK-2細(xì)胞的自噬活性過(guò)程中，AMPK/mTOR信號(hào)通路與ERS密切相關(guān)。主要依據(jù)如下：(1)ERS能調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路的蛋白活性。結(jié)果顯示，加入ERS激活劑Thapsigargin之后， AMPK/mTOR信號(hào)通路激活，相反，ERS抑制劑Salubrinal增加AMPK的磷酸化和抑制mTOR的磷酸化，提示ERS能激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路。(2)加入Thapsigargin之后，HK-2細(xì)胞的自噬活性受到抑制，而加入Salubrinal之后AOPPs的效應(yīng)部分被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為自噬水平有所上升。結(jié)合前述AMPK/mTOR介導(dǎo)了AOPPs引發(fā)的自噬抑制，可以推測(cè)ERS可能通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)AOPPs對(duì)HK-2細(xì)胞自噬活性的抑制作用。此前，大量研究均提示ERS的發(fā)生能誘發(fā)自噬水平的上調(diào)[14]，而在本研究中，ERS的存在對(duì)自噬水平的調(diào)控發(fā)揮了抑制作用，這可能與ERS與自噬所處的環(huán)境及作用的時(shí)間差異有關(guān)。在細(xì)胞受到外界刺激的初始階段，ERS的發(fā)生與自噬水平的上調(diào)都是對(duì)細(xì)胞具有應(yīng)對(duì)外界刺激的保護(hù)及適應(yīng)作用，有助于恢復(fù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而持續(xù)存在的ERS會(huì)產(chǎn)生警戒信號(hào)，最終使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷變?yōu)椴豢赡?，此時(shí)可能抑制自噬水平，對(duì)細(xì)胞造成級(jí)聯(lián)式的損傷。

綜上所述，本研究首次提出ERS通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路參與了AOPPs誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞自噬活性的抑制過(guò)程。本研究提出了HK-2細(xì)胞自噬活性調(diào)節(jié)的新機(jī)制，抑制或阻斷ERS及AMPK/mTOR信號(hào)通路，對(duì)增加腎小管上皮細(xì)胞自噬活性、防治腎間質(zhì)纖維化具有重要意義，為研究腎間質(zhì)纖維化提供了新的方向。