補陽還五湯對缺氧預(yù)適應(yīng)心臟成纖維細(xì)胞促心臟干細(xì)胞遷移的影響

金鑫瑤 朱 征 陳 娜 李 娜 曾文赟 王一婧 姜希娟

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

心肌梗死為臨床常見急危重癥，其發(fā)病率有上升趨勢。心肌梗死最主要的病理改變是冠脈狹窄堵塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞的缺血缺氧甚至壞死。心臟成纖維細(xì)胞(CFs)為心肌最主要的細(xì)胞成分，其旁分泌作用對于維持心肌細(xì)胞微環(huán)境有重要作用。Messina等〔1，2〕研究表明心臟干細(xì)胞能自我更新、多能分化，其一旦被激活，可迅速遷移、分化形成心肌和冠脈血管。心肌局部缺血缺氧可激活誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞遷移〔3〕，而CFs在心肌缺血缺氧時其旁分泌作用可能對于心臟干細(xì)胞的遷移有重要影響。補陽還五湯作為臨床常用的治療心肌梗死后氣虛血瘀證的藥物，其具體的作用機(jī)制不詳〔4〕。本實驗研究補陽還五湯對缺氧預(yù)適應(yīng)心臟成纖維細(xì)胞促心臟干細(xì)胞遷移的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新生1～2 d的昆明小鼠，雌雄不限。

1.2實驗藥物及試劑 補陽還五湯飲片購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國藥堂；8 μm孔徑Transwell小室購自美國Corning公司(3422)；DMEM/F12培養(yǎng)基干粉袋購自美國Gibco公司(12400-024)；兔抗小鼠Vimentin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(PB0378)；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司(C3886)；FastLine細(xì)胞到cDNA快速制備試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化科技有限公司(KR105、205-02)；SCF酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、SDF-1 ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司(SEA120Mu、SEA122Mu)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 ①CFS的培養(yǎng)及鑒定：新生的昆明小鼠按文獻(xiàn)〔5〕的方法獲得原代及傳代培養(yǎng)的CFS。實驗時將培養(yǎng)的細(xì)胞同步化。取傳代2次后的CFS爬片至蓋玻片上，經(jīng)Vimentin免疫熒光染色鑒定，陽性染色細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上，符合后續(xù)實驗要求。②心臟干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：小鼠心臟干細(xì)胞，由美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈，培養(yǎng)方法同前。經(jīng)c-kit免疫熒光染色鑒定，陽性染色細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上，符合實驗要求。

1.4CFS缺氧預(yù)適應(yīng)模型的建立 取生長狀態(tài)良好的第2代細(xì)胞，消化后離心，調(diào)整細(xì)胞密度為4.8×105/ml，以每孔2.5 ml接種至6孔板中。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后置于三氣培養(yǎng)箱(5%CO2+94%N2+1%O2)中缺氧預(yù)適應(yīng)24 h，復(fù)制缺氧模型。

1.5補陽還五湯含藥血清的制備及實驗分組 兩組SD大鼠分別用生理鹽水、補陽還五湯(原方劑量根據(jù)徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學(xué)》等效換算法計算出大鼠生藥量為12.87 g/kg)持續(xù)灌胃1 w。制備出空白胎牛血清(FBS)及補陽還五湯含藥血清，經(jīng)高效液相色譜分析該含藥血清符合實驗要求。將實驗分為對照組(缺氧0 h+10%空白FBS)、模型組(缺氧24 h+10%空白FBS)和補陽還五湯組(缺氧24 h+10%含補陽還五湯的FBS)。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，收集各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液上清及CFS，置于-80℃保存以備后續(xù)實驗使用。

1.6心臟干細(xì)胞遷移實驗 無菌條件下打開內(nèi)置8 μm孔徑Transwell小室的24孔板，每個小室內(nèi)加入200 μl含2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)濕化2 h。每個小室內(nèi)加入100 μl 細(xì)胞密度為1×105的心臟干細(xì)胞懸液，而24孔板內(nèi)分別加入600 μl各組CFS培養(yǎng)液上清，于37℃培養(yǎng)12 h。取出各組Transwell小室，用棉球小心擦去小室膜上側(cè)細(xì)胞，保留膜下側(cè)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡小室洗滌細(xì)胞2次。4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，經(jīng)PBS洗滌2次。再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次，風(fēng)干后200倍鏡下選取5個視野計算心臟干細(xì)胞遷移數(shù)，重復(fù)實驗3次取其平均值。

1.7RT-PCR法檢測各組CFS中SCF、SDF-1 mRNA的表達(dá) 按FastLine細(xì)胞到cDNA快速制備試劑盒說明操作，快速制備出經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的cDNA，經(jīng)微量紫外分光光度計檢測cDNA濃度。以cDNA為模板，按SYBR Green試劑盒說明操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成，具體引物序列見表1。配成25 μl反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，2×SuperReal premix plus 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.75 μl，下游引物(10 μmol/L)0.75 μl，50×Rox reference dye 0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。設(shè)定PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 min，預(yù)變性及熱啟動→95℃ 10 s，變性→60℃ 30 s，退火→40個循環(huán)→72℃充分延伸。實驗數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算出各樣品中目的基因的相對表達(dá)量。每組6個樣本，每樣重復(fù)3孔，實驗獨立重復(fù)3次。

表1 具體引物序列

1.8ELISA檢測各組CFS培養(yǎng)液上清中SCF、SDF-1蛋白旁分泌量 按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔，除空白孔不加外，其余孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品50 μl，立即加入檢測溶液A工作液50 μl，貼覆膜，37℃恒溫箱孵育1 h；棄去液體，洗滌液充分洗滌，加入檢測溶液B工作液100 μl，貼覆膜，37℃溫育30 min；棄液洗滌，再加底物溶液90 μl，貼上覆膜，37℃避光顯色20 min；出現(xiàn)梯度藍(lán)色時，加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔光密度(OD)，每組6個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次，取其平均值。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組CFS培養(yǎng)液對心臟干細(xì)胞遷移的影響 由圖1發(fā)現(xiàn)：與對照組(29.83±5.98)相比，模型組心臟干細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多(41.00±4.73，P<0.05)，提示缺氧24 h可促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移；而補陽還五湯組進(jìn)一步增加心臟干細(xì)胞的遷移數(shù)(50.50±8.02)，較之模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明補陽還五湯具有促心臟干細(xì)胞遷移的作用。

2.2各組CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達(dá) 模型組SCF、SDF-1 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而補陽還五湯組上調(diào)SCF、SDF-1 mRNA的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，提示補陽還五湯可能通過上調(diào)缺氧預(yù)適應(yīng)的CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移，見表2。

圖1 結(jié)晶紫染色觀察心臟干細(xì)胞遷移情況(×100)

表2 各組培養(yǎng)液上清中SCF、SDF-1 mRNA表達(dá)情況

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

2.3各組CFS培養(yǎng)液中SCF、SDF-1的蛋白分泌情況 由表3得出，模型組SCF、SDF-1蛋白分泌水平較之對照組下調(diào)，SCF差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SDF-1蛋白分泌雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組SCF、SDF-1蛋白分泌水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，提示補陽還五湯可能通過促進(jìn)缺氧預(yù)適應(yīng)CFS分泌SCF、SDF-1蛋白進(jìn)而促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中SCF、SDF-1蛋白分泌情況

3 討 論

急性心肌梗死歸屬中醫(yī)學(xué)“真心痛”、“厥心痛”的范疇，氣虛血瘀為其主要病機(jī)。補陽還五湯出自清代王清任之《醫(yī)林改錯》，方由生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g組成，具有補氣活血、祛瘀通絡(luò)之功效，故在臨床上也常用于心肌梗死后氣虛血瘀證的治療。

心肌主要由心肌細(xì)胞和CFS組成，心肌細(xì)胞是心臟的功能單位，而CFS為心肌細(xì)胞提供支架作用，維持心肌的結(jié)構(gòu)，同時還參與維持心臟正常的電生理功能〔6〕。而近年來發(fā)現(xiàn)的心臟干細(xì)胞具有維持心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及參與心臟重構(gòu)作用〔7〕，其一旦被激活，可迅速遷移、分化形成心肌和冠脈血管。因此，促進(jìn)心臟干細(xì)胞向梗死區(qū)域遷移至關(guān)重要。有研究表明，當(dāng)冠脈狹窄或痙攣時，其相應(yīng)的心肌組織處于缺血缺氧狀態(tài)，可誘導(dǎo)少量心臟干細(xì)胞遷移至該區(qū)域，并分化為心肌細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)受損心肌功能的恢復(fù)〔8，9〕。本實驗通過心臟干細(xì)胞遷移試驗，發(fā)現(xiàn)缺氧24 h預(yù)適應(yīng)的培養(yǎng)液可增加心臟干細(xì)胞遷移數(shù)，驗證了上述研究結(jié)論；而補陽還五湯含藥血清干預(yù)后，心臟干細(xì)胞遷移數(shù)進(jìn)一步增多，表明補陽還五湯具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移的作用。此外，缺血缺氧可促使心臟成纖維細(xì)胞旁分泌一系列遷移相關(guān)細(xì)胞因子(如SCF、SDF-1等)，而這可能對于心臟干細(xì)胞具有一定的趨化作用〔5〕。SCF可與受體c-kit特異性結(jié)合，對c-kit+心臟干細(xì)胞有強烈趨化作用〔10〕，因此SCF/c-kit在參與心肌梗死初始幾個小時內(nèi)的干細(xì)胞動員、遷移中發(fā)揮重要作用〔11〕，而這種作用可能是通過活化p38MAPK信號通路實現(xiàn)的〔12〕。SDF-1及其受體CXCR4為促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移的重要因子〔13〕，諸多因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等對心臟干細(xì)胞的遷移作用往往依賴于SDF-1/CXCR4軸的調(diào)節(jié)〔14〕。Wang等〔15〕證實SDF-1/CXCR4軸通過激活PI3K/Akt通路介導(dǎo)心肌干細(xì)胞遷移，實現(xiàn)修復(fù)心肌的作用。本實驗表明補陽還五湯可能通過上調(diào)缺氧預(yù)適應(yīng)CFS中SCF、SDF-1 mRNA表達(dá)，增加SCF、SDF-1蛋白分泌，進(jìn)而促進(jìn)心臟干細(xì)胞遷移。