CD40對晚期上皮性卵巢癌新輔助化療敏感性的預(yù)測價值

陳曉晴　劉玉玲

[摘要]目的 通過檢測卵巢癌組織中的CD40表達(dá)水平，判斷新輔助化療（NACT）對卵巢癌中CD40分子表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步推斷CD40分子是否可以作為預(yù)測卵巢癌化療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志。方法 選取2015年12月～2017年12月在我院就診的晚期上皮性卵巢癌患者80例，根據(jù)術(shù)前有無進(jìn)行NACT，分為行NACT者30例，為A組，未行NACT者50例，為B組，對應(yīng)的卵巢癌組織術(shù)后病理石蠟切塊分別為30枚和50枚。采用免疫組織化學(xué)方法檢測兩組卵巢癌組織中的CD40分子表達(dá)水平。結(jié)果 A組的化療總有效率（80.00%）明顯高于B組（58.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。A組的CD40陽性表達(dá)率（56.67%）低于B組（80.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；A組中化療有效者CD40的陽性表達(dá)率（45.83%）明顯低于化療無效者（100.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CD40在晚期卵巢癌中的表達(dá)與Ki-67成正相關(guān)（r=0.539，P=0.000）。結(jié)論 CD40在晚期卵巢癌NACT者和未行NACT中的表達(dá)差異顯著。CD40可以作為預(yù)測新輔助化療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物，有助于指導(dǎo)NACT在晚期卵巢癌中的應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]卵巢癌；新輔助化療；CD40；Ki-67；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（c）-0017-04

[Abstract]Objective To determine the influence of neoadjuvant chemotherapy （NACT） on the expression of CD40 in ovarian cancer，and further infer whether the CD40 molecule can be used as a biological marker to predict the chemosensitivity of ovarian cancer by examining the expression of CD40 in ovarian cancer tissue.Methods Eighty patients with advanced epithelial ovarian cancer treated in our hospital from December 2015 to December 2017 were selected and they were classified into group A （n=30） given NACT and group B （n=50） without NACT according to whether they performed neoadjuvant chemotherapy before surgery or not.The corresponding paraffin sections of ovarian cancer tissues were 30 and 50 respectively.Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD40 in two groups of ovarian cancer tissue.Results The total effective rate of chemotherapy in group A （80.00%） was significantly higher than that of group B （58.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in group A （56.67%） was lower than that of group B （80.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in chemo effective patients （45.83%） was significantly lower than that in chemo ineffective patients （100.00%） of group A，and the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of CD40 in advanced ovarian cancer was positively correlated with Ki-67 （r=0.539，P=0.000）.Conclusion The expression of CD40 was significantly different between NACT and NACT of advanced ovarian cancer.CD40 can be used as a biomarker for predicting the sensitivity of NACT，and it helps to guide the application of NACT in advanced ovarian cancer.

[Key words]Ovarian cancer；Neoadjuvant chemotherapy；CD40；Ki-67；Immunohistochemistry

卵巢癌是女性生殖道最常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率在婦科腫瘤中居首位[1]?，F(xiàn)階段卵巢癌主要采用手術(shù)+鉑類化療方案，對于不能直接進(jìn)行手術(shù)治療的患者，采用新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT）。但是目前NACT的應(yīng)用缺乏更加規(guī)范化、個體化的治療標(biāo)準(zhǔn)，且導(dǎo)致卵巢癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚不明確。

CD40是具有48-50KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白[2-3]。研究表明CD40除了廣泛表達(dá)于B細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等外，在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌、宮頸癌及彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤組織中也呈高表達(dá)。

目前對于CD40在卵巢癌中表達(dá)的研究較少，尤其是CD40對NACT的敏感性，故本課題現(xiàn)對行NACT者及未行NACT者，通過免疫組織化學(xué)方法檢測兩組行NACT后和未行NACT卵巢癌組織中的CD40表達(dá)水平，通過Ki-67來量化CD40與晚期卵巢癌NACT敏感性的關(guān)系，判斷NACT對卵巢癌中CD40分子表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步推斷CD40分子是否可以作為預(yù)測卵巢癌化療敏感性的生物學(xué)標(biāo)志。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2017年12月在我院就診的80例晚期卵巢癌患者，其中行NACT聯(lián)合間歇性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)者30例，為A組，年齡為44～73歲，平均53歲；未行NACT而行初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)者50例，為B組，年齡為41～69歲，平均50歲。實驗對象：采用免疫組織化學(xué)方法檢測NACT者晚期卵巢癌術(shù)后病理石蠟塊標(biāo)本30枚、行初始腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)晚期卵巢癌病理石蠟塊標(biāo)本50枚。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者入院前未進(jìn)行任何治療；②A組術(shù)前影像學(xué)檢查顯示大量腹腔積液、盆腔包塊、腹膜轉(zhuǎn)移；③A組術(shù)前血清CA125>1000 U/ml；④A組術(shù)前均行1～3個周期的化療；⑤A組術(shù)前均通過影像學(xué)檢查、超聲引導(dǎo)下穿刺引流，并且術(shù)后確診為晚期上皮性卵巢癌者；⑥所有研究對象臨床資料完整，且簽署知情同意書。所有行NACT的患者均按照最新《NCCN指南》中的標(biāo)準(zhǔn)NACT紫杉醇+鉑類（TP）方案進(jìn)行。所有入組患者均行理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)。實驗中涉及的受試者權(quán)益和倫理學(xué)均符合有關(guān)規(guī)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無術(shù)后明確病理診斷者；②合并其他惡性腫瘤者；③術(shù)前評估不能耐受該手術(shù)者。

1.3 療效評價標(biāo)準(zhǔn)

完全緩解（CR）：所有病灶消失，且CA125≤35 U/ml；部分緩解（PR）：靶病灶最大直徑之和減少>30%，CA125>35 U/ml或者CA125下降最初高值的50%；疾病穩(wěn)定（SD）：靶病灶最大直徑之和減少30%或者增加病灶未達(dá)病情進(jìn)展（PD），或CA125值未見明顯增高；PD：靶病灶最大直徑之和增加>20%，出現(xiàn)新的病灶，或者CA125值升高至正常水平的2倍以上?；熅徑?部分緩解+完全緩解。

1.4 實驗主要試劑和方法

鼠抗人CD40單克隆抗體（H-10）：13128購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體購自基因科技（上海）有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP染色法。實驗步驟：①將石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，在78℃烤箱進(jìn)行烤片1 h；②脫蠟：二甲苯中進(jìn)行脫蠟5～10 min，用PBS（pH=7.4）反復(fù)沖洗；③抗原修復(fù)：在盛有檸檬酸鹽修復(fù)液（pH=6.0）的高壓鍋中，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗3 min×3次；④阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次；⑤將1滴（約50 μl）第一抗體滴加在每張切片中，CD40和Ki-67抗體的工作濃度為1∶100，放入4℃冰箱中過夜；⑥加入反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫下孵育20 min；⑦將1滴（50 μl）二抗即酶標(biāo)抗鼠聚合物滴加在每張切片中，在室溫下孵育50 min后去除PBS液；⑧滴加DAB顯色劑進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察染色效果；⑨終止顯色，進(jìn)行復(fù)染、分化，自來水反復(fù)沖洗，PBS沖洗；⑩用梯度乙醇進(jìn)行脫水干燥，使用二甲苯透明及中性樹膠封片。操作步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行，以提供的陽性對照片作為陽性對照，陰性對照片除用PBS代替一抗外，其余步驟相同。

1.5結(jié)果判定

所有的CD40和Ki-67的切片均由病理科兩位高年資醫(yī)生對結(jié)果進(jìn)行判定。CD40染色陽性為棕黃色，主要存在于細(xì)胞膜上，胞質(zhì)著色亦為陽性。Ki-67主要定位于細(xì)胞核，胞質(zhì)、胞核同時呈棕黃色亦為陽性。每張切片隨機(jī)觀察10個高倍視野（10×40），每個視野取100個細(xì)胞，記分標(biāo)準(zhǔn)參照免疫反應(yīng)計分法（immuno reactive score，IRS） 基于3個參數(shù)的半定量記數(shù)方法：染色強(qiáng)度評分以無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞所占比例評分以陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為0分，25%～50% 為1分，50%～75% 為2分，>75%為3分；每例最后得分為A項×B項：0分為陰性，1分為弱陽性（+），2～3 分為陽性（++），>3分為強(qiáng)陽性（+++） 。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期卵巢癌不同化療時機(jī)的臨床療效的比較

A組化療總有效率為 80.00%，B組為58.00%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 A、B組中CD40陽性表達(dá)率的比較

A組的CD40陽性表達(dá)率為56.67%，B組為80.00%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3 NACT者中不同臨床療效組CD40陽性表達(dá)率的比較

A組中化療有效組CD40的陽性表達(dá)率為45.83%，無效組陽性率為100.00%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.4 CD40與Ki-67在晚期卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)性

CD40 與 Ki-67在晚期卵巢癌中的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.539，P=0.000）（表4）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因的復(fù)雜過程。卵巢癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確，且生存率較低尤其是晚期卵巢癌患者。對于巨塊型的卵巢癌患者或者直接失去手術(shù)時機(jī)的晚期卵巢癌患者，因為其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯早，或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高，單純手術(shù)治療不能取得滿意的治療效果。近年來，有學(xué)者提出在術(shù)前應(yīng)用NACT，應(yīng)用于晚期卵巢癌。雖然目前的研究結(jié)果顯示NACT可以提高卵巢癌患者的生存質(zhì)量，減少腫瘤復(fù)發(fā)[4]，并且有文獻(xiàn)指出NACT聯(lián)合中間性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)對晚期卵巢癌的治療有效[5-7]，但是尋找預(yù)測NACT敏感性的指標(biāo)尤為重要。

CD40位于20號染色體上，是由8個內(nèi)含子和9個外顯子組成的長臂[8]。CD40可以在B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，但是正常組織中檢測含量較少。有研究表明，CD40分子可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖作用[9]。CD40的配體為CD40L，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40和CD40L的特異性結(jié)合是CD40介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要步驟。CD40介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以誘導(dǎo)T、B細(xì)胞活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子，參與自身免疫性疾病的發(fā)病過程[10-11]。隨著越來越多的研究證明，CD40分子與上皮性腫瘤的分化、浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，與腫瘤血管形成也有關(guān)[12]。CD40與單核細(xì)胞表面受體結(jié)合從而誘導(dǎo)基質(zhì)釋放金屬蛋白酶，從而使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲[13]。另有研究表明，CD40分子可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖作用[14]。主要是因為惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)少或者不表達(dá)免疫原性細(xì)胞克隆產(chǎn)物，所以可以逃離免疫細(xì)胞的識別和監(jiān)視。CD40分子是免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的“中介”，通過產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，在這兩種細(xì)胞間傳遞信息，發(fā)揮作用。CD40成為現(xiàn)在研究腫瘤發(fā)生機(jī)制及腫瘤治療中的研究熱點。

本研究結(jié)果顯示，晚期卵巢癌NACT者CD40陽性表達(dá)率低于未行NACT者（P<0.05）。本研究只是研究晚期卵巢癌，對CD40的陽性表達(dá)是否與腫瘤分期未作研究，但是在黃沁等[15]的研究中指出臨床分期與CD40分子的表達(dá)無明顯相關(guān)性（P>0.05）。黃建安等[16]的研究指出，CD40分子的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P<0.05）。故CD40分子的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系還不明確，需要更多的研究來證實。但是根據(jù)本研究結(jié)果NACT可以降低CD40在晚期卵巢癌中的表達(dá)，提示CD40對NACT有敏感性。

本研究中在NACT有效組中CD40的陽性表達(dá)率低于無效組（P<0.05），提示在NACT組有效者中CD40表達(dá)下降。結(jié)合本研究中NACT者中CD40分子陽性率低于未行NACT者CD40分子陽性率，推測可能是因為化療藥物主要是作用于增殖中的細(xì)胞使得細(xì)胞周期停滯，從而使細(xì)胞凋亡，而CD40與CD40L連接使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，化療藥物的作用和CD40與CD40L的作用類似，有可能是化療藥物與CD40信號產(chǎn)生的“協(xié)同作用”，從而產(chǎn)生更好的治療效果。這與Yahara等[17]研究的CD40與CD40L結(jié)合可以提高腫瘤細(xì)胞對輔助化療的敏感性的結(jié)論相似，提示CD40分子可以作為預(yù)測NACT敏感性的腫瘤標(biāo)志物，并且CD40與CD40L的結(jié)合可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和引導(dǎo)細(xì)胞周期的停滯，并在一定程度上可誘導(dǎo)敏感細(xì)胞的凋亡，從而成為腫瘤治療研究新的熱點。

Ki-67核抗原是存在于增殖細(xì)胞中的相關(guān)性抗原。它在增生活躍的細(xì)胞中普遍表達(dá)，但是在“靜止”細(xì)胞中表達(dá)不明顯或者不表達(dá)，并且在細(xì)胞的周期的各個階段都有表達(dá)，除外有絲分裂G0期，正是因為這種特別的生物學(xué)特征使Ki-67成為可以反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的非?？煽康纳飿?biāo)志物。Ki-67在腫瘤組織中的表達(dá)含量越高，表明腫瘤細(xì)胞的增殖活性越高?；熕幬镆舱亲饔糜谶@種增殖活躍的癌細(xì)胞，其具有最強(qiáng)的致死性并且能夠快速的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明Ki-67與腫瘤對化療的敏感性有關(guān)。Ki-67能更好地反映增殖活躍的細(xì)胞的數(shù)量，過度的表達(dá)常促使細(xì)胞增生，對惡性和良性腫瘤的鑒別有一定意義[18]。

Ki-67已經(jīng)應(yīng)用于多種惡性腫瘤細(xì)胞的鑒別中，如有研究指出在口腔鱗狀細(xì)胞癌中術(shù)前應(yīng)用NACT后Ki-67陽性率下降，認(rèn)為可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Qin等[19]、Wu等[20]也分別分析了乳腺癌、胃癌患者NACT后Ki-67陽性率明顯下降，證實了Ki-67與預(yù)測NACT的敏感性有關(guān)。

本研究中CD40與Ki-67共表達(dá)的分析表明兩者表達(dá)成正相關(guān)（r=0.539，P=0.000）。CD40與Ki-67的表達(dá)存在一定的“協(xié)同作用”，提示Ki-67高表達(dá)者，化療有效率高，對化療敏感；同時CD40也存在高表達(dá)者，化療有效，這也是從另一方面證實CD40可以預(yù)測晚期卵巢癌NACT敏感性。在臨床中Ki-67已經(jīng)被用來檢測卵巢癌的惡性程度，根據(jù)Ki-67與CD40的“協(xié)同作用”，聯(lián)合檢測晚期卵巢癌患者中CD40和Ki-67的表達(dá)情況，對于預(yù)測晚期卵巢癌NACT的敏感性及檢測卵巢癌的惡性程度具有重要的臨床意義。

綜上所述，CD40和Ki-67分子在卵巢癌的中的異常表達(dá)對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有重要意義，并且兩者存在協(xié)同作用，兩者在預(yù)測卵巢癌NACT的敏感性有重要意義，但是對于CD40在卵巢癌中的作用機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究，也許不久的將來CD40分子也可以作為治療卵巢癌的靶分子應(yīng)用到卵巢癌的治療中。

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（收稿日期：2018-04-08 本文編輯：許俊琴）