魔芋膳食纖維固體飲料中優(yōu)勢菌的分離、初步鑒定及菌相分析

劉健 秦磊磊 李素媛 周陶鴻 江一飛 黃龍 羅愛玲

摘要：對(duì)魔芋膳食纖維固體飲料中的微生物進(jìn)行分離及初步鑒定，同時(shí)對(duì)飲料生產(chǎn)環(huán)境背景菌進(jìn)行調(diào)查，以此確定魔芋膳食纖維固體飲料中的優(yōu)勢菌，并對(duì)菌相成因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，6個(gè)批次樣品共分離得到32株菌，其中革蘭氏陽性芽孢短桿菌27株，革蘭氏陽性芽孢長桿菌2株，革蘭氏陰性長桿菌1株，霉菌2株。6個(gè)批次樣品均未分離得到腸桿菌、葡萄球菌及乳酸菌。背景菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飲料生產(chǎn)環(huán)境空氣中共分離得到200株菌，其中103株為芽孢桿菌。從干燥車間接觸表面分離得到9株菌，全部為芽孢桿菌。表明芽孢菌為魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品菌相優(yōu)勢菌，與其生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)環(huán)境存在一定的關(guān)聯(lián)性。

關(guān)鍵詞：魔芋膳食纖維固體飲料； 菌相； 優(yōu)勢菌； 背景菌

中圖分類號(hào)：TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）14-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.014 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To ascertain dominant microorganisms in konjac dietary fiber solid drinks，and analysis the reason for the bacteria existence，the bacteria in the product as well as in the production environment were isolated and identified. The results showed that 32 strains of bacteria were found in six batches of samples，including 27 strains gram positive bacillus，2 strains of gram positive long coli bacillus，2 strains of moulds，1 strain of gram-negative bacillus，no enterobacteriaceae，lactic acid bacteria and staphylococcus. Through the investigation of background bacteria in the production environment，200 strains of microorganisms were isolated from the atmosphere， including 103 strains bacillus. Among them，9 bacillus were isolated from the contact surface of drying workshop. Results indicated that bacillus was the dominant microorganisms of konjac dietary fiber solid drinks. There is a certain correlation with the production process and the production environment.

Key words： konjac dietary fiber solid drinks； microflora； dominant bacteria； background bacteria

魔芋膳食纖維是目前發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)良可溶性膳食纖維之一， 具有多種良好的食品學(xué)特性，其保健功能也日益受到人們的重視，目前已廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品、化工等領(lǐng)域[1]。目前，魔芋制品的質(zhì)量安全問題關(guān)注點(diǎn)集中在魔芋制品生產(chǎn)過程中二氧化硫、生物堿、重金屬及農(nóng)藥殘留問題，但關(guān)于魔芋制品微生物指標(biāo)檢驗(yàn)檢測方法的研究卻寥寥無幾。魔芋膳食纖維固體因其特殊的飲用方法，其產(chǎn)品衛(wèi)生狀況值得高度關(guān)注，產(chǎn)品中的微生物種類及數(shù)量是評(píng)價(jià)產(chǎn)品衛(wèi)生狀況的重要依據(jù)。

魔芋膳食纖維具有非常強(qiáng)的吸水性，對(duì)其產(chǎn)品微生物指標(biāo)按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測時(shí)樣品迅速吸水膨脹，流動(dòng)性極差，容易帶來微生物無法均勻分布的問題，無法準(zhǔn)確定量定性，給企業(yè)自檢及監(jiān)管檢測帶來困難。

本試驗(yàn)對(duì)魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品中的微生物及生產(chǎn)環(huán)境中背景菌進(jìn)行分離和初步鑒定，研究魔芋膳食纖維中的優(yōu)勢微生物及其與生產(chǎn)環(huán)境的關(guān)系，旨在為魔芋膳食纖維固體飲料生產(chǎn)環(huán)節(jié)的自檢和政府監(jiān)督檢測其衛(wèi)生指標(biāo)時(shí)篩選適用稀釋液提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)而指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)控制。

1 材料與方法

1.1 材料

魔芋膳食纖維固體飲料及該固體飲料廠家生產(chǎn)環(huán)境。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基、Baird-parker培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、7%氯化鈉胰胨水、氧化酶試紙、過氧化氫、GN鑒定卡、GP鑒定卡、BCL鑒定卡、革蘭氏染色液、芽孢染色液。

試驗(yàn)設(shè)備主要有生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、滅菌鍋、生物安全柜、顯微鏡、生化鑒定儀VITEK2-compact。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)品中微生物的分離 在潔凈室稱取0.1 g樣品于無菌平皿中，每個(gè)樣品3次重復(fù)，分別傾注營養(yǎng)瓊脂、MRS、VRBGA、PDA、Baird-parker培養(yǎng)基，混勻，待瓊脂凝固后于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[2]，培養(yǎng)條件見表1。

1.2.2 生產(chǎn)環(huán)境中背景菌采集

1）空氣采樣。取樣方法參照GB/T 16293-2010[3]、GB/T 16294-2010[4]的測試方法，采集動(dòng)態(tài)環(huán)境空氣中的微生物，將采集的微生物置于36 ℃培養(yǎng)48 h。

2）接觸面采樣。取樣方法參照文獻(xiàn)[5]，采集生產(chǎn)設(shè)備、器具接觸面的微生物，每個(gè)設(shè)備器具選取5個(gè)采樣點(diǎn)。將采集的微生物置于36 ℃培養(yǎng)48 h。

3）工人手采樣。取樣方法參照文獻(xiàn)[5]，每個(gè)工序選取1名工人，將采集的微生物置于36 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.3 微生物的分離及初步鑒定 從瓊脂培養(yǎng)基上挑取菌落，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血平板上進(jìn)行平板劃線分離以得到純化的單菌落，觀察其菌落特征[6]。進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色，觀察其個(gè)體形態(tài)特征，并進(jìn)行相應(yīng)的生理生化試驗(yàn)（氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、嗜鹽試驗(yàn)）[7，8]，利用生化鑒定儀鑒定到科和屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品菌相的初步分離及鑒定

如表2、表3所示，通過分離和初步鑒定，6個(gè)批次樣品共分離32個(gè)菌落，其中革蘭氏陽性芽孢短桿菌27株，1株不溶血，菌落形態(tài)存在一定的差異，菌體大小存在一定差別，芽孢形成位置為中生；革蘭氏陽性芽孢長桿菌2株，其中1株不溶血，菌落形態(tài)存在差異，芽孢為中生。革蘭氏陰性長桿菌1株，不溶血，經(jīng)VITEK鑒定為泛菌屬（圖1、圖2）；霉菌2株。6個(gè)批次樣品均未分離到腸桿菌、葡萄球菌及乳酸菌。

2.2 生產(chǎn)環(huán)境背景菌分析

2.2.1 空氣背景菌 通過測定洗粉車間、真空干燥間及內(nèi)包間空氣中浮游菌及沉降菌，共采集到200株菌，通過菌落形態(tài)及芽孢染色，初步判斷其中芽孢菌103株，生產(chǎn)環(huán)境空氣中存在較大數(shù)量的芽孢菌，各車間背景菌情況見圖3。內(nèi)包間為潔凈廠房，魔芋精粉半成品在內(nèi)包間內(nèi)進(jìn)行分裝，內(nèi)包間共采集到16株菌，其中芽孢菌10株，經(jīng)洗粉及干燥后，內(nèi)包車間空氣中浮游菌、沉降菌數(shù)量及其中芽孢數(shù)量均有比較明顯的減少，但芽孢菌屬仍為主要背景菌。

2.2.2 接觸面背景菌 對(duì)洗粉車間投料口及出料口，真空干燥車間轉(zhuǎn)用車、閃蒸車間入料口及出料口、內(nèi)包間投料口及卷膜軸表面微生物進(jìn)行采集，在真空干燥車間轉(zhuǎn)用車表面、閃蒸車間入料口、閃蒸車間出料口分別采集到3、2、4 CFU/g，均為芽孢菌（表4）。

2.2.3 工人手背景菌 在內(nèi)包間工人雙手表面未采集到菌株，工人手經(jīng)過嚴(yán)格清洗消毒后對(duì)產(chǎn)品菌相構(gòu)成影響較小。

2.2.4 各工序產(chǎn)品衛(wèi)生狀況 分別采集洗粉、真空干燥、閃蒸工序產(chǎn)品及原料進(jìn)行菌落總數(shù)測定（表5），洗粉及真空干燥工序產(chǎn)品菌落總數(shù)分別為20、10 CFU/g，閃蒸工序產(chǎn)品菌落總數(shù)為40 CFU/g，均為芽孢菌，原料魔芋微粉菌落總數(shù)為3 700 CFU/g，所得菌株多數(shù)為芽孢菌。

通過對(duì)生產(chǎn)車間、接觸面及各工序樣品背景菌調(diào)查，空氣中芽孢菌數(shù)量占總分離菌株的51.5%，原料魔芋微粉中芽孢菌數(shù)量占菌落總數(shù)的81.1%，接觸面及各工序樣品中所分離菌株均為芽孢菌，初步推斷芽孢菌屬為生產(chǎn)環(huán)境背景優(yōu)勢菌。

2.3 產(chǎn)品菌相與生產(chǎn)環(huán)境背景菌規(guī)律

原料中存在大量的芽孢菌，這可能與魔芋生長土壤環(huán)境及魔芋微粉生產(chǎn)工藝及環(huán)境有較大關(guān)系，前期工序粉塵較大，原料中潛在的芽孢菌可能對(duì)生產(chǎn)環(huán)境空氣存在較大影響。

根據(jù)表5可知，經(jīng)過長時(shí)間的乙醇洗粉及真空干燥，基本能夠滅活原料中的微生物，僅少量耐受性較強(qiáng)的芽孢菌仍可存活，洗粉及真空干燥均在密閉管道中進(jìn)行，空氣中芽孢菌對(duì)前期工序產(chǎn)品菌相構(gòu)成影響不大。

閃蒸工序樣品中芽孢菌數(shù)量有一定的增加，閃蒸車間投料口與真空干燥間未完全隔斷，在真空干燥間轉(zhuǎn)用車、閃蒸車間入料口及出料口均采集到一定數(shù)量的芽孢菌，空氣環(huán)境、轉(zhuǎn)用過程、閃蒸管道衛(wèi)生這些因素均有可能造成真空干燥工序產(chǎn)品一定程度的二次污染，閃蒸工序采用氣流干燥，干燥溫度較低，僅為50 ℃左右，可能對(duì)管道及半成品中潛在的芽孢菌滅活能力減弱，從而造成該工序末端產(chǎn)品中含有芽孢菌。內(nèi)包間為潔凈車間，其空氣中存在一定數(shù)量的芽孢菌，來源可能是半成品粉塵。芽孢菌在空氣中較難清除，可長期存在，可能給環(huán)境及產(chǎn)品帶來持續(xù)污染?？諝猸h(huán)境、接觸面、半成品及終產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌具有一致性，原料微粉、空氣環(huán)境及閃蒸管道可能為芽孢菌的主要來源。

3 小結(jié)與討論

從魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品中分離得到32株菌，其中29株屬于芽孢菌屬，芽孢菌屬為魔芋膳食纖維固體飲料菌相優(yōu)勢菌。從生產(chǎn)環(huán)境中亦分離到大量的芽孢菌，魔芋膳食纖維生產(chǎn)工藝中需用乙醇對(duì)魔芋精粉進(jìn)行純化，乙醇可使細(xì)菌蛋白凝固從而對(duì)大多數(shù)細(xì)菌具有較強(qiáng)的殺滅作用，同時(shí)生產(chǎn)工藝中涉及高溫真空干燥過程，可殺滅大多數(shù)細(xì)菌，但部分芽孢可耐受高溫不被殺死。因此，本試驗(yàn)得出的宜昌地區(qū)魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品菌相構(gòu)成主要為芽孢菌屬，與產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及環(huán)境有一定的關(guān)聯(lián)性。

由于魔芋膳食纖維固體飲料生產(chǎn)過程中經(jīng)過洗粉、高溫真空干燥等工藝，菌落總數(shù)會(huì)大大降低。但芽孢菌屬對(duì)惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的抗性，芽孢可在環(huán)境中長期存活[9]，較難清除，部分條件致病芽孢菌數(shù)量達(dá)到一定限值后會(huì)對(duì)人體造成一定損害，本試驗(yàn)排除所用材料中存在蠟樣芽孢的可能，但空氣及管道中芽孢菌的長期積累依然可能造成產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)不合格，企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)芽孢菌的控制，由于粉塵及空氣可能為污染的主要來源，建議企業(yè)各工序之間采取全封閉管道生產(chǎn)，可有效降低產(chǎn)品污染。

本試驗(yàn)從產(chǎn)品中所分離菌株未能鑒定到種，需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其危害性，同時(shí)需采取其他技術(shù)手段[10，11]分析加工過程中各環(huán)節(jié)的微生物種群多樣性，比較各環(huán)節(jié)菌群的差異，對(duì)比各環(huán)節(jié)分離菌株的一致性，進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)品芽孢菌污染主要來源，以便更好地指導(dǎo)企業(yè)對(duì)環(huán)境及工藝進(jìn)行改造。

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