環(huán)境監(jiān)測生物實驗室底棲動物標本庫建設

張 翔, 于 璐, 徐東炯, 顧娟娜, 吳禮裕

(1. 常州市環(huán)境監(jiān)測中心, 江蘇 常州 213001； 2. 常州市人居環(huán)境檢測防治中心, 江蘇 常州 213001)

0 引 言

底棲動物是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成[1]，對其監(jiān)測現(xiàn)已成為水環(huán)境生物監(jiān)測的重要部分[2]，是江蘇省政府率先批復實施的《江蘇省太湖流域水生態(tài)環(huán)境功能區(qū)劃(試行)》[3]中是水生態(tài)健康指數(shù)的重要組成，直接關系到太湖流域水生態(tài)管理目標。

底棲動物標本庫是環(huán)境監(jiān)測實驗室底棲動物的監(jiān)測和研究的基礎，其完善程度直接影響到底棲動物分類鑒定的準確性和可信性，是實驗室不可或缺的一部分。針對生物多樣性研究，國內各大高校及科研院所會依據(jù)研究方向和內容建設其標本庫，但大多集中在植物、魚類、獸類、禽類和鳥類等，專門建設針對底棲動物的標本庫以海洋底棲動物為主，淡水極少涉及，且無完善的管理規(guī)則。這使得國內擁有底棲動物標本庫的單位無法正常交流標本，也無法提升底棲動物的研究水平。本文致力于底棲動物標本庫建設的步驟和質量控制研究，覆蓋實驗室管理中對人員、器材、物料、環(huán)節(jié)、方法的規(guī)定，相關實驗室可直接將其用作底棲動物標本庫建設與管理的規(guī)范參考文件。

1 底棲動物標本庫建設目的和現(xiàn)狀

對于底棲動物標本的分類鑒定，主要依靠科研院所和環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)的論文、書籍，現(xiàn)雖已是彩色圖片與個體特征介紹的圖文并茂形式，但其浸制標本庫的建設依然不健全，“一個標本勝千言”[4]，這不僅涉及生物監(jiān)測、科研工作，更是對環(huán)境管理、環(huán)境保護的準確性、科學性、推廣性有重要現(xiàn)實意義。

底棲動物標本庫構成主要為浸制標本，部分為干制標本和玻片標本，其建設是生物監(jiān)測應用于環(huán)境管理的支撐，也是底棲動物監(jiān)測標準化、系統(tǒng)化、QA/QC的一部分，在科研、監(jiān)測中占有重要地位。在國外主要依托博物館對標本進行收集和管理。歐美的大型自然歷史博物館均已將標本視為世界文化遺產，只要出于科研需要，任何國家和地區(qū)的人員均有權使用，而且一般都得到博物館的支持和幫助。但在國內博物館的標本主要以保存為主，許多標本都難以借出[5]。

2 底棲動物標本庫的建設

2.1 標本獲取與固定

野外采集底質，為獲得小型個體和早期生命階段的各種底棲無脊椎動物使用60目標準篩洗凈樣品[6]，僅為獲得大型底棲無脊椎動物使用40目標準篩洗凈樣品，經專業(yè)知識人員挑揀其中的底棲動物裝入樣本瓶(PET、PP材質)，用80%乙醇溶液初步固定，固定液分多次加入并晃動樣本瓶，保證標本從麻醉到固定，否則將因劇烈脫水導致標本破壞，固定后液面必須沒過標本最高處1倍。當挑揀中存在大個體軟體動物時，需單獨存放，最好以10%福爾馬林(4%甲醛)溶液固定，固定液面沒過標本最高處；如加入80%乙醇溶液固定，則固定后液面必須沒過標本最高處1倍。

75%乙醇溶液因其滲透性強和吸收蛋白質水分的原因，使得生物細胞脫水變性達到殺菌目的，進而保存標本；10%福爾馬林(4%甲醛)溶液因能很快與蛋白質反應變性達到殺菌目的，同時將蛋白質轉換為可阻止標本腐爛的不溶性樹脂，進而保存標本[7]。但兩者在使用中，由于標本挑揀時不可避免地帶入少量水分和生物個體含水率高的原因，使得固定液濃度在加入時就會下降，而受兩種固定液固定標本原理的不同，初次添加的固定液以80%乙醇溶液和10%福爾馬林(4%甲醛)溶液為宜。在配置固定液前必須檢視乙醇原液和甲醛原液，原液純度達工業(yè)級以上，但液體必須清澈透亮，不能存在沉淀或雜質。特別是甲醛原液，高濃度甲醛原液在低溫下會形成乳白色固體沉淀，剩下溶液實際為含甲醛極少的水[8]，萬不可棄去沉淀后做原液使用。配置固定液所使用的水干凈清澈，不苛求去離子水或純凈水。配置好的乙醇溶液易揮發(fā)，甲醛溶液對人體有害，均需密封保藏且盡快使用。

如標本需進行DNA條形碼識別時，需以無水乙醇(分析純及以上)保存，使用5 ℃已冷卻24 h以上的無水乙醇保存最佳，可提取含雜質較少的DNA。

2.2 標本初步篩選

在標本固定后1～3 d由分類人員將標本進行初步篩選，剔除挑揀時帶出的雜質，將大小差異較大的標本分開存放，并置換同濃度的新固定液。在篩選過程中對顏色不同的底棲動物予以記錄，可文字記錄或直接拍照留存。需進行DNA條形碼識別的標本，初次置換下的無水乙醇保存液需置于5 ℃低溫并做好記錄。

2.3 標本分類鑒定

由受訓后的形態(tài)學分類人員對獲得的標本進行形態(tài)學分類鑒定，需參考現(xiàn)有已發(fā)表的文字、圖片、影像資料和自然歷史博物館的館藏憑證標本，分類完成時按各自的門、綱、目、科、屬、種進行歸類，盡可能分類至屬、種級別，但必須保證準確有依據(jù)，單個結果由分析人員、審核人員共同作出。淡水底棲動物主要包括軟體動物門(Mollusca)、環(huán)節(jié)動物門(Annelida)、節(jié)肢動物門(Arthropoda)、扁形動物門(Platyhelminthes)、線形動物門(Nematomorpha)、線蟲動物門(Nematoda)、紐形動物門(Nemertea)等。

2.4 標本圖片拍攝

對已完成形態(tài)學分類鑒定的標本，依照整體照、特征照的形式，對每個標本拍攝不少于2張標本圖片，要求能全面反映標本的形態(tài)特征，照片與標本相對應。

2.5 標本DNA條形碼信息

需DNA條形碼識別的標本使用無菌剪、無菌手術刀片獲取動物組織：昆蟲、甲殼動物取足部，環(huán)節(jié)動物、軟體動物、扁形動物取身體軟組織(避開消化道)，如個體實在太小(如部分搖蚊幼蟲)，則選取完整個體，用純水和75%乙醇溶液分別清洗取出的身體組織約5 mg，保證無雜質、無污染[9]。如所獲取的標本DNA條形碼信息非供初建標本庫使用，可用初次置換下的無水乙醇保存液做提取DNA的材料。接著進行DNA提取、PCR擴增與產物電泳、基因序列測定分析以獲得標本DNA條形碼信息。

2.6 鑒定完畢標本制作與記錄

生物標本主要有剝制標本、浸制標本、干制標本和玻片標本等類型，環(huán)境生物監(jiān)測底棲無脊椎動物標本保存、利用以浸制標本為主，以干制標本及玻片標本為輔。鑒定完畢后大型軟體動物外殼滅菌晾干制成干制標本；需用顯微鏡觀察的可制成以加拿大樹膠封片的玻片標本；其余均可制成浸制標本。浸制標本制作時需先對底棲動物用去離子水清洗，洗去固化的體液及雜質殘留，再將較大的底棲動物裝入大口密封盒，將較小的其他動物標本放入透明玻璃制螺紋口標本瓶中，加入80%乙醇溶液或5%福爾馬林(2%甲醛)溶液。配置保存液的原液以工業(yè)級純度及以上為佳，水以去離子水及以上為佳，以免形成少量絮狀沉淀。標本容器材質以硅硼玻璃、有機玻璃為佳，蓋上107硅橡膠[10]或泡沫硅橡膠為內襯的塑料密封蓋，塑料密封蓋需良好的抗化學物質性，一般PET、PP材質均可。標本容器大小可依據(jù)標本大小定制，常用大口密封盒為1～3 L容積，螺紋口標本瓶為20～50 mL容積，固定液面不低于容積的3/4。

干制標本的外殼、玻片標本的玻片、浸制標本的標本瓶外均需貼制標簽，詳細記錄標本信息：標本編號、物種名稱、拉丁文名稱、標本性別、采集地點、采集日期、保存介質、鑒定人員、制作標本機構名稱。進行DNA條形碼識別的標本增加相應二維碼標識，表明其特征DNA序列。

完成標本制作后，填寫記錄：標本圖片、標本實物、鑒定記錄都一一對應。

2.7 標本審核

對已制作完成的標本，執(zhí)行標本審核：先由受過底棲動物分類鑒定訓練而非鑒定者本人復核，再由經驗豐富的底棲動物分類鑒定主管或科研院所相關專家審核標本制作、標本信息是否正確完整，審核完成后，在相關證明材料上簽字。如審核出現(xiàn)疑問的標本，可先置于暫存柜，待累積到一定量后，請相關權威專家甄別做出審核意見，根據(jù)意見最終完成標本審核。

2.8 標本入庫、展示與維護保養(yǎng)

對審核完成的標本進行入庫，按照標本柜中已經分區(qū)的動物類別上架，同時將文本資料、電子資料歸檔，交由檔案管理部門統(tǒng)一管理。

對已入庫的標本可用作展示，主要以標本柜為整體進行，標本柜分區(qū)可對不同物種進行展示，大型軟體動物展示效果較好；其他動物可以將個體與顯微鏡照片對應，在標本展示區(qū)設置顯示屏，通過標號一一調用其顯微鏡照片，保證科學性、直觀性。

實體標本入庫時保證完好，應先對保存柜需先進行一次清潔后移入標本瓶。實體標本保存房間保持可通風，室溫(20±5) ℃，濕度小于70%，避免陽光直射，每3個月檢視標本，固定液減少的添加至原有量，如甲醛溶液因生成仲甲醛而渾濁，乙醇溶液出現(xiàn)發(fā)黃的情況，必須更換原固定液。此外，還需進行防塵措施，可設置防塵緩沖帶和定期對標本瓶外進行擦拭以除塵，同時對地面塵土進行清掃，確保無塵。標本在搬運后易出現(xiàn)受損，需及時維護到位[11]。

2.9 參考標本

為確認分類鑒定結果，所有鑒定出的實物樣品均可作為參考標本。單個點位的參考標本需一一記錄，標本庫、暫存柜內單個點位的標本信息都需以單獨的報表或表格登記，明確：采集地點、采集日期、采樣量、物種名稱、學名、門類、樣品編號、固定劑成分、鑒定日期、個體數(shù)量(個)、個體質量(g)、個體密度(個/m2)、生物量(g/m2)、鑒定日期、鑒定人員、復核人員、審核人員。保存方法與一般標本相同。參考標本確認的有關要求包括：

(1) 參考標本的確認可進行同行評議，但最終確認必須由底棲無脊椎動物分類鑒定顧問組2～3專家鑒定簽字確認，顧問組專家為國內大型底棲無脊椎動物分類鑒定公認的知名專家，不同的人僅負責自己的專業(yè)領域。

(2) 參考標本的確認具體進行如下工作：① 對制作單位提出的物種鑒定報告(須闡述鑒定的主要依據(jù))提出質詢。② 判斷待審侯選參考標本的鑒定是否正確，確認相應實驗室對該物種的分類鑒定能力。③ 判斷待審侯選參考標本的主要特征是否典型鮮明，具有普遍性和代表性，是否適合作為參考標本。④ 評估待審侯選參考標本的完好性及質量，判斷其是否適合作為參考標本。⑤ 專家間產生異議，意見不能統(tǒng)一的，以不通過定論。⑥ 對意見一致的待審侯選參考標本出具參考標本鑒定結果報告，簽字確認。

(3) 必要時，可咨詢專家給出相應物種分類鑒定的方法，經驗及注意事項等。

2.10 憑證標本(模式標本)

憑證標本是一類受權威專家認可、個體特征明顯、DNA信息明確、標本保存完好、記錄完整、需永久保存的實物標本，又稱模式標本，包括物種發(fā)現(xiàn)時的正模標本、副模標本和配模標本，但又不局限于物種發(fā)現(xiàn)時的這幾類稀有標本。這類標本可以幫助確認其種類的特征，也能幫助確認新物種的發(fā)現(xiàn)和已知物種的新記錄。所有的憑證標本必須在管理部門、相關組織機構登記，單獨保存，單獨建卡，保存等級遠高于一般標本，每次維護保養(yǎng)均需涉及并仔細檢查，標本出現(xiàn)問題需及時處理并將情況公告、上報。一般來說，普通實驗室的普通人員要接觸到憑證標本的可能性小，因此，環(huán)境監(jiān)測生物實驗室必須建立自己的參考標本和參考標本庫。

2.11 樣地標本

樣地標本是按固定或不固定時間間隔采集典型樣地的樣品，經分類鑒定、計量統(tǒng)計后獲得，樣地標本標識典型樣地、采樣時間、采樣人員、固定劑成分、已鑒定生物名稱及表格(包括學名)、鑒定日期、鑒定人員等，以浸制標本、玻片標本、干制標本等形式，按典型樣地-采樣時間-生物類型等要素分類保存，樣地標本為永久保藏標本，應盡量避免損壞，可從中取樣進行研究利用。

2.12 標本錄入、查詢與調用

標本電子數(shù)據(jù)同實物一同入庫，數(shù)據(jù)資料在輸入后需經復核、審核，妥善歸檔保存，從而可以進行數(shù)據(jù)查詢和用作水生態(tài)健康管理的原始數(shù)據(jù)予以調用。

3 底棲動物標本庫的管理制度

3.1 底棲動物標本出入庫管理制度

(1) 底棲動物標本入庫時經制作、復核、審核后方可入庫，登記為參考標本的單獨記錄并歸檔，登記為憑證標本的除單獨記錄和歸檔外還需環(huán)境管理部門登記。所有標本供本區(qū)域范圍生態(tài)環(huán)境質量監(jiān)測、生物多樣性保護規(guī)劃參照和歷史比對、科研分析和交流、科普活動和展覽等項目使用。

(2) 僅在本單位調用參考標本時，需做好登記：使用標本目的、出庫時間、歸還時間、有無損壞、經手人簽名等信息；當外單位調用參考標本時，向本單位做出使用標本目的、出庫時間、歸還時間、標本由何人何地進行使用的說明，單位審批同意后即可外借，同時內部也需做好登記。

(3) 憑證標本為科研項目的實施和運行提供基礎的支撐、保障作用[12]。其調用必須向管理部門、相關組織機構報批，同意后方可進行操作，并將使用標本目的、出庫時間、歸還時間、標本由何人何地進行使用出具詳細書面說明，經單位審核后方可外借，同時在實施過程中應根據(jù)實際情況制定細則。

(4) 底棲動物標本出庫后歸還入庫時，需要工作人員、管理人員認真檢查，保證無破損、無遺失[13]。如有破損或遺失情況，應及時上報并追究出借方責任，同時標本庫人員需盡可能對標本進行保養(yǎng)修復。

應構建長效性扶持機制，項目支持不只局限于前期建設階段，也應向中后期運行階段延伸。加大政策扶持力度，提高項目資金補助標準，補貼應盡可能彌補秸稈收儲人工和運輸成本，提高秸稈利用主體積極性。實行區(qū)別化補貼和獎勵標準，引導產業(yè)發(fā)展向技術含量高、附加值高的利用方向發(fā)展。拓寬政策扶持廣度，降低項目申報門檻，盡可能讓政策惠及每一個產業(yè)鏈主體，最大限度調動各方面積極性。政府部門需密切協(xié)作、形成合力，在財政、稅收、土地等各方面完善政策優(yōu)惠體系，通過完善利益鏈驅動產業(yè)鏈發(fā)展，最終形成以政策為導向、企業(yè)為主體、農民廣泛參與的秸稈綜合利用長效機制。

3.2 底棲動物標本保藏管理制度

(1) 底棲動物標本保存房間應建立專人負責制，指定工作人員和管理人員，每3個月對標本保存情況、保存設施檢查記錄并進行保養(yǎng)維護。具備滅火設施和影像監(jiān)控，保證房間安全，每周對房間進行打掃、通風，做好記錄。

(2) 底棲動物標本保存房間需具備溫濕度調控器、溫濕度計或在線溫濕度監(jiān)控，并按時進行記錄，室溫保持(20±5) ℃，濕度小于70%，避免陽光直射。

(3) 每3個月檢視實體標本和電子數(shù)據(jù)，出現(xiàn)保存液渾濁變色、標簽脫落或字跡不清、標本瓶密封問題或損壞、電子運行故障時，應及時更換、修復、備份，保證其正常。

4 底棲動物標本庫的質量控制

4.1 人員質控

涉及底棲動物項目所有人員需納入單位人員管理程序統(tǒng)一管理，參與底棲動物分類鑒定和底棲動物標本庫工作的人員，必須由技術管理部門經過專業(yè)培訓，具備相應資格和經驗，具有對結果做出正確判斷能力和熟知質量要求的人員方可上崗。

實驗室底棲動物方向技術管理者應為獲得在底棲動物研究范圍內的實驗室認可與計量認證成員，并具有生物專業(yè)或底棲動物研究專業(yè)密切相關的本科以上學歷和5年以上底棲動物研究專業(yè)相關的工作經歷。

建立省級底棲無脊椎動物分類鑒定專家組及顧問組，專家組由省內環(huán)境監(jiān)測中心有10年以上大型底棲無脊椎動物分類鑒定經驗、高級工程師職稱以上的專家組成，顧問組由國內外大型底棲無脊椎動物分類鑒定知名專家組成。專家組作為底棲無脊椎動物分類鑒定QA/QC的管理的執(zhí)行機構，省級質量管理相關部門定期組織專家組對有關實驗室進行培訓、考核、質量檢查、同行評議、實驗室間比對及能力驗證等工作。顧問組作為咨詢機構提供參考標本最終確認等咨詢服務。每2～3年，必須接受與底棲動物研究相關的一次培訓或一次會議，同時實驗室資料應保持隨時更新。同時相關的培訓、參會和資料更新需予以留檔備查。

4.2 器材質控

涉及底棲動物項目所用器材需納入單位儀器設備管理程序統(tǒng)一管理，對儀器設備使用、維修、保養(yǎng)、報廢進行有效控制，所有的儀器設備均有明顯標識表明其狀態(tài)，對結果有影響的采樣設備和實驗室設備，均需加以唯一性標識。

底棲動物室內研究使用的顯微鏡包括體視顯微鏡和正置顯微鏡兩種，攜帶測微尺和拍照功能為佳，稱重所用天平為萬分之一天平。需對顯微鏡、天平定期維護保養(yǎng)保持性能良好，并做好使用記錄、維護保養(yǎng)記錄、使用期間核查記錄、修理記錄等。

保存底棲動物的保存容器保證密封、堅固、具良好的抗化學物質性，存放底棲動物的房間保持可通風，室溫20±5℃，濕度小于70%，避免陽光直射，存放情況需予以記錄。

4.3 標本質控

底棲動物實體標本制作和電子資料制作均需符合生物實驗室底棲動物標本庫的相關要求，實施質量控制可采用(但不限于)以下方式：

(1) 定期使用參考標本、憑證標本對不同分類級別進行標本制作內部質量控制。

① 準確度控制。將多個不同門、綱、目、科的參考標本混合制成定量標本，控制分類級別為門、綱、目、科的底棲動物分類準確度；將多個不同屬、種的參考標本不同分類特征部位制成概念標本，控制分類級別為屬、種的底棲動物分類準確度[14]，以公式計算正確率，控制限為80%，高于此限判為合格；

② 雙樣精密度控制[15]。將某種憑證標本和同種的參考標本進行對比觀察，分別描述其分類特征的區(qū)別，描述后確認其偏差。但標本特征不同于理化數(shù)值，不同人員描述均會產生不同程度的偏差，故有時也在物種雙名法定名人名字后，添加不同描述人名字予以標注，甚至一些新種、亞種的發(fā)現(xiàn)也離不開多次描述。精密度僅控制學術上公認的核心特征，雙樣對比描述相對偏差容許值應為10%，低于此限判為合格：

式中：X1為憑證標本核心特征數(shù)；X2為同種參考標本核心特征數(shù)。

(2) 參加同一標本不同實驗室間比對和能力驗證活動。

(3) 監(jiān)控同一人員不同標本分析制作能力及不同人員對同一標本分析制作能力[16]。

(4) 同一標本形態(tài)學分類和DNA條形碼監(jiān)測結果比對分析。

(5) 定期監(jiān)控、審核電子資料，比對國內外發(fā)表的論文、網站資料與實體標本情況，更新完善電子資料。

4.4 記錄質控

涉及底棲動物項目所用記錄需納入單位記錄控制程序統(tǒng)一管理，對記錄的識別、收集、索引、使用、存檔、維護和處置進行有效控制。

底棲動物標本庫記錄需質量記錄和技術記錄，質量記錄有標本庫內部審核記錄和標本庫管理體系文件控制記錄；技術記錄有標本采樣分析記錄、標本審核記錄、標本保存記錄、標本庫流轉記錄、參考標本檔案記錄、憑證標本檔案記錄、人員培訓考核記錄、實驗室間比對和能力驗證記錄、儀器設備使用維護運行記錄、標本質量控制評審記錄。

5 結論和展望

本文以環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)生物實驗室對底棲動物的分類鑒定和標本制作多年經驗總結，詳細介紹從底棲動物標本獲取到研究獲得的所有信息，以及這些信息的保存、利用、流轉的各個步驟和對其進行的質量控制手段，為獲得真實、詳細、準確、易用的底棲動物數(shù)據(jù)做出探索，同時為豐富和規(guī)范底棲動物資源庫，保護和宣傳底棲動物多樣性做貢獻。

底棲動物標本庫的建立對底棲動物的研究、標本交流、多樣性發(fā)展有意義重大，在學校及科研院所展開對其形態(tài)學、遺傳學的研究，可以闡明生物分布、進化、交流的各種信息；在環(huán)境監(jiān)測、水文水利等政府部門展開對其分布情況的研究，可以闡明環(huán)境污染情況和環(huán)境保護需要對應的方向，同時進行系統(tǒng)內的質控和技術培訓；在博物館、資源中心、科教館展開對其收集、維護、展出，可以達到對公眾的教育科普。未來更可以綜合以上部門的需求，讓同一標本發(fā)揮其不同功能，甚至與世界大型博物館的標本進行交流，使得標本庫與國際接軌。