基于高通量測(cè)序技術(shù)的潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者腸道菌群多樣性的研究＊

丁龐華，李軍祥，郭 一，毛堂友，趙興杰＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚未明確，病變呈連續(xù)性，可累及直腸、結(jié)腸的黏膜層及黏膜下層的慢性非特異性炎癥性疾病[1]，主要影響15-40歲的中青年人。UC屬于終身疾病，臨床上以腹痛、腹瀉、黏液膿血便等為主要表現(xiàn)，其病程反復(fù)遷延不愈，以發(fā)作、緩解和復(fù)發(fā)交替為特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一，也是目前消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。隨著近年來生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變、環(huán)境的變化，以及診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，UC的發(fā)病率和患病率也呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢(shì)，我國目前的UC患病率約為11.6/10萬[2]。UC病程遷延不愈，復(fù)發(fā)率高，UC的嚴(yán)重并發(fā)癥—潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌占UC患者死亡原因的9%-11%[3]。

目前，UC的病因尚不清楚，研究者普遍認(rèn)為UC的發(fā)病與宿主共生的腸道菌群紊亂，免疫功能失調(diào)，氧化應(yīng)激以及炎癥介質(zhì)的參與等有關(guān)[4]。盡管UC發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但腸道內(nèi)固有菌群的分布與UC的關(guān)系是近年的研究熱點(diǎn)。研究者普遍認(rèn)為UC的發(fā)病與宿主共生的腸道菌群紊亂有著密切的關(guān)系，認(rèn)為腸道內(nèi)菌群是UC發(fā)病過程中的啟動(dòng)和促進(jìn)因素，在UC的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[5]。而大腸濕熱證作為活動(dòng)期UC的最主要證型[6]，其生物學(xué)內(nèi)涵具有重要的研究?jī)r(jià)值，因此本課題組選取活動(dòng)期大腸濕熱證的潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康人群的糞便作為標(biāo)本，用16S rRNA二代測(cè)序的方法檢測(cè)標(biāo)本的菌群豐度及多樣性，從而比較健康人群與大腸濕熱證的潰瘍性結(jié)腸炎患者之間腸道菌群的差異，以探討腸道菌群在潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者發(fā)病過程中的可能存在的作用。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見（2012年·廣州）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照2017年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)制訂的《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識(shí)意見》［8］。大腸濕熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：主癥：（1）腹瀉黏液膿血便（2）腹痛（3）里急后重；次癥：（1）肛門灼熱（2）身熱不揚(yáng)；（3）口干口苦（4）小便短赤；舌脈：舌質(zhì)紅苔黃膩；脈滑數(shù)。

證型確定:具備主癥2項(xiàng)（第1、2項(xiàng)必備）加次癥1項(xiàng)，參考舌脈即可診斷。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合UC活動(dòng)期標(biāo)準(zhǔn)的初發(fā)型或慢性復(fù)發(fā)型患者；（2）根據(jù)改良Truelove和Witts疾病嚴(yán)重程度分型標(biāo)準(zhǔn)，病情屬于輕中度UC；（3）中醫(yī)辨證屬大腸濕熱者；（4）年齡18-65歲；（5）自愿參加并簽署知情同意書者。

過去一年于朦朧是這樣度過的：用330天的時(shí)間在劇組里演戲，用不在劇組的時(shí)間錄制完整張音樂新專輯。工作日夜輪轉(zhuǎn)無休，于朦朧反而對(duì)工作越來越生出眷戀之心，劇組在哪兒，心就定在哪兒。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）有嚴(yán)重并發(fā)癥，如局部狹窄、腸梗阻、腸穿孔、中毒性巨結(jié)腸、直腸癌、結(jié)腸癌及肛門疾病者；（2）妊娠或正準(zhǔn)備妊娠的婦女及哺乳期婦女；（3）過敏體質(zhì)及對(duì)多種藥物過敏者；（4）合并肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及精神病患者；（5）仍在進(jìn)行其他潰瘍性結(jié)腸炎治療方案的患者；（6）3個(gè)月內(nèi)參加其他臨床研究項(xiàng)目的患者近。

1.2 臨床資料

患者為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科2017-07/2017-12就診為UC的患者；本研究共包括28名志愿者，其中14例潰瘍性結(jié)腸炎（UC）隨機(jī)選擇同期健康人群14例作為對(duì)照組，病例組男性6例、女性8例；對(duì)照組男性6例、女性8例。由于抗生素對(duì)腸道菌群影響較大，要求所有病例在采樣前均未接受過任何抗生素治療，正常對(duì)照者3月內(nèi)未發(fā)生過消化系統(tǒng)疾病,也未使用過抗生素，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。所有參與實(shí)驗(yàn)者均已簽署實(shí)驗(yàn)知情同意書，且該項(xiàng)目通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 糞便樣本DNA提取、文庫構(gòu)建及測(cè)序

DNA提?。焊咄繙y(cè)序?qū)NA的完整性有較為嚴(yán)格的要求。采用糞便DNA提取試劑盒提取糞便組織中DNA，通過Qubit對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量，并通過Agilent 2100對(duì)DNA完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)DNA質(zhì)量達(dá)到要求的樣本進(jìn)行文庫構(gòu)建。

文庫構(gòu)建：采用獨(dú)特的二步PCR方法進(jìn)行樣本文庫構(gòu)建。以不同樣本DNA為模板，通過PCR反應(yīng)完成第一輪擴(kuò)增。采用磁珠法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，分別用含有不同index的引物（該引物含有與測(cè)序flow cell上面接頭配對(duì)的序列、區(qū)分不同樣本之間的index序列及懸掛接頭序列的一部分）進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，再經(jīng)磁珠純化后，分別用Qubit和Agilent2100對(duì)文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫將采用Illumina Hiseq2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。

本項(xiàng)目采用Illumina公司的HiSeq2500測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。該測(cè)序平臺(tái)可以針對(duì)16S rRNA的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，樣本制備文庫的DNA起始量可低至50 ng。文庫制備完成后，簇生成和測(cè)序都在HiSeq2500上完成。

1.3.2 測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果根據(jù)不同的標(biāo)簽序列區(qū)分不同的樣品相關(guān)序列并建立相應(yīng)文庫，用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類分析，并進(jìn)一步完成各文庫中可操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs）分析。依托新一代DNA測(cè)序儀和計(jì)算平臺(tái)，經(jīng)過宏基因組分析技術(shù)得到腸道菌群分布。

2 結(jié)果

2.1 PCA分析及PLS-DA分析

PCA分析（圖1A）和PLS-DA（圖1B）顯示兩組之間存在顯著差異，Adonis/PERMANOVA多元方差分析和置換檢驗(yàn)以及Anosim相似度分析均表明潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人群之間有顯著性差異，P值分別為0.008和0.002（圖1）。

圖1 A：PCA分析，B：PLS-DA分析（Clotis：潰瘍性結(jié)腸炎組；Healthy：健康人群組）

2.2 門水平分析

結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人腸道菌群的差異（圖2）：其中，大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎患者的擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）的細(xì)菌均低于健康人，但是變性菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的比例高于健康人；圖3結(jié)果示：Alpha多樣性分析：潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者的多樣性均高于健康人腸道樣本。

2.3 潰瘍性結(jié)腸炎

大腸濕熱證患者與健康人群的LDA結(jié)果，潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人群腸道菌群的豐度之間存在顯著的差異，其中健康人群中以類桿菌科（Bacteroidaceae）、多形桿狀菌（Bacteroides）、硬壁菌門（Firmicutes）、梭菌屬（Clostridia）等為主；潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者以乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、Erysipelotrichaceae、Erysipelotrichales等為主。以上結(jié)果均證實(shí)潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人群之間的腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)確實(shí)存在著顯著的差異（圖4）。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病是一個(gè)涉及多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的過程，其中包括遺傳、環(huán)境、感染、免疫等多種因素[9]。盡管發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為環(huán)境和遺傳因素、腸道微生態(tài)失調(diào)、適應(yīng)性免疫失常和（或）有缺陷的細(xì)胞自噬與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并提出UC的本質(zhì)可概括為遺傳易感人群中被異常放大的腸道黏膜免疫反應(yīng)[10]。

圖2 門水平上潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康人腸道細(xì)菌差異（Clotis：潰瘍性結(jié)腸炎組；Healthy：健康人群組）

潰瘍性結(jié)腸炎是由易感基因、粘膜免疫和腸道微生態(tài)等多重因素共同作用所導(dǎo)致的疾病，其具體的發(fā)病機(jī)制尚待進(jìn)一步完善與發(fā)現(xiàn)，而腸道微生態(tài)在其中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)UC中腸道菌群失調(diào)，并表現(xiàn)在菌群多樣性的下降以及豐度的改變，且失衡的腸道菌群與UC的疾病活動(dòng)度有著一定的聯(lián)系。NEMOTO等［11］收集了48例潰瘍性結(jié)腸炎患者的糞便，結(jié)果發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便腸道菌群的多樣性明顯降低。其中，類桿菌和梭狀芽孢桿菌顯著減少，而腸球菌的數(shù)量明顯高于健康受試者。王艷等［12］將收治的401例潰瘍性結(jié)腸炎患者進(jìn)行Mayo評(píng)分并分期對(duì)比，分析其菌群失調(diào)度和免疫球蛋白水平發(fā)現(xiàn)，疾病活動(dòng)度與菌群失調(diào)程度呈正相關(guān)，隨著病情加重，患者的免疫力也逐漸下降。

圖3 潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康人樣本的Alpha多樣性分析（Clotis：潰瘍性結(jié)腸炎組；Healthy：健康人群組）

在腸道內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)定方面，腸道菌群起到不可或缺的作用；正常的腸道菌群在腸道的防御、物質(zhì)的合成以及代謝、生長(zhǎng)和衰老等諸多方面都起到重要的作用。當(dāng)腸道菌群發(fā)生比例的失調(diào)、某些菌株的定位轉(zhuǎn)移時(shí)，腸道疾病就會(huì)明顯加重，人體衰老的進(jìn)程加速，甚至?xí)l(fā)生癌變。有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的失調(diào)可能是UC發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)［13］。UC患者中菌群的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重失衡，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門菌、空腸彎曲菌、艱難梭菌、瘤胃球菌屬、腸桿菌科、變形菌門、放線菌門等普遍增高;柔嫩梭菌、厚壁菌門、梭菌群Ⅳ、擬桿菌門等均減少[14]。當(dāng)腸道炎癥發(fā)生時(shí)，腸道菌群的失衡能夠破壞共生菌群與宿主免疫系統(tǒng)之間的動(dòng)態(tài)平衡，誘發(fā)腸道產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[15,16]。當(dāng)宿主的腸道菌群發(fā)生紊亂時(shí)，腸道內(nèi)大量的致病菌繁殖，破壞了腸道固有的粘膜屏障，同時(shí)因?yàn)槟c道致病菌的侵入，腸道通透性也進(jìn)一步的被擴(kuò)大，進(jìn)而使得大量的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物透過固有的黏膜屏障進(jìn)入到機(jī)體，從而影響到腸道的免疫功能，最終導(dǎo)致UC的發(fā)生［17］。

有研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎不同中醫(yī)證候之間腸道菌群的數(shù)量以及豐度存在一定的差異。陳韻如研究發(fā)現(xiàn)，相較于潰瘍性結(jié)腸炎脾氣虛證的患者，脾胃濕熱證患者的糞便中雙歧桿菌高于前者；而與健康人群相比，脾胃濕熱證患者的糞便中雙歧桿菌、大腸桿菌含量與健康人群無明顯差異[18]。李舒通過16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)、脾胃氣虛、脾虛胃熱單重證型的腸道菌群16S V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)：與健康人群組相比，濕熱內(nèi)蘊(yùn)和脾虛濕熱患者厚壁菌門比例較低，以韋榮球菌較為突出。脾虛濕熱患者腸道內(nèi)的變形桿菌門高于脾胃氣虛患者，而變形桿菌門中的嗜血桿菌中，濕熱內(nèi)蘊(yùn)組所占比例均高于另外2個(gè)證候。擬桿菌在濕熱內(nèi)蘊(yùn)組中高于健康人組。普氏菌在3組證候中均低于健康人。棒狀桿菌在濕熱內(nèi)蘊(yùn)患者中高于脾胃氣虛。真桿菌屬在脾胃氣虛組和脾虛濕熱組中低于健康人組[19]。

結(jié)合臨床中UC的表現(xiàn)，濕熱是UC的重要病理因素，劉河間在《原病式》中就指出“諸瀉痢皆屬于濕，濕熱甚于腸胃之內(nèi)，而腸胃怫郁，以致氣液不得宣通而成”。根據(jù)UC活動(dòng)期患者腹痛、腹瀉和黏液膿血便這一最大特點(diǎn)，中醫(yī)多將該病歸屬于“腸澼”或“久痢”的范疇，其中大腸濕熱證的病因病機(jī)復(fù)雜多樣，外感濕熱之邪，或飲食不節(jié)，脾胃受傷；或情志不暢，惱怒傷肝，肝氣犯脾；或郁思傷脾，日久導(dǎo)致脾胃虛弱，運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，濕郁化熱，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，濕熱與腸道氣血相搏結(jié)，氣血凝滯，化為膿血，從而導(dǎo)致發(fā)病。根據(jù)最新的有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎各時(shí)期證型的聚類分析結(jié)果顯示，大腸濕熱證占所有類型的34.8%，活動(dòng)期的大腸濕熱證所占的比例可高達(dá)48%[6]。且研究認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎不同中醫(yī)證候之間腸道菌群的數(shù)量以及豐度存在一定的差異[15,16]。因此，大腸濕熱證作為UC活動(dòng)期最基本的中醫(yī)證型，從腸道微生態(tài)角度探索其生物學(xué)內(nèi)涵具有重要的臨床價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。

本次研究通過宏基因組學(xué)16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人群的菌群構(gòu)成。在研究中通過PCA分析和PLS-DA發(fā)現(xiàn)大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康人之間腸道菌群存在明顯差異；在門水平上兩組之間的腸道菌群存在顯著差異；通過Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸道菌群的多樣性高于健康人群；以及LDA結(jié)果顯示大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎患者與健康人群腸道菌群的豐度之間存在顯著差異。且研究中發(fā)現(xiàn)Akkermansia菌在潰瘍性結(jié)腸炎患者中處于富集狀態(tài)，結(jié)合其以往的報(bào)道顯示與肥胖和炎癥呈負(fù)相關(guān)，因此我們大膽提出Akkermansia可能是一種可以破壞腸道粘膜的細(xì)菌，在有潰瘍存在的時(shí)候更適應(yīng)其生長(zhǎng)與繁殖，屬于大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎的特異菌種，可能在大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵性作用，為下一步研究大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)菌群以及大腸濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)微生物學(xué)機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

本研究作為初步探索性研究，結(jié)果提示潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者的腸道菌群較正常人有一定差異。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎腸道菌群的分布與中醫(yī)的辨證分型之間存在著一定的聯(lián)系[18,19]。這為我們進(jìn)一步挖掘腸道菌群與潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證之間的相關(guān)性，并通過腸道菌群揭示大腸濕熱證的生物學(xué)內(nèi)涵提供了重要的前期基礎(chǔ)。本次研究中發(fā)現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與正常人之間腸道菌群的差異，其中某些菌群的特異性的增加或減少導(dǎo)致了腸道菌群的失衡，可能破壞了人體免疫平衡；這為我們進(jìn)一步研究潰瘍性結(jié)腸炎腸道病變的發(fā)生發(fā)展提供了可能的方向。且本研究所揭示的與UC相關(guān)的菌群結(jié)構(gòu)變化特征也將有助于更深入地研究宿主和腸道菌群之間在代謝和免疫等方面的相互作用，并揭示菌群在UC發(fā)生發(fā)展過程中的作用。本研究運(yùn)用當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者腸道菌群的特異性，其中某些菌群的改變?cè)诮窈蟮倪M(jìn)一步的研究中，可作為評(píng)價(jià)潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者的參考指標(biāo)，定期檢測(cè)某些菌群豐度的改變有助于判斷腸道菌群的恢復(fù)情況，對(duì)治療效果的評(píng)判有重要的臨床價(jià)值。

圖4 潰瘍性結(jié)腸炎大腸濕熱證患者與健康人群的LDA結(jié)果（Clotis：潰瘍性結(jié)腸炎組；Healthy：健康人群組）

雖然本次研究能夠觀察到大腸濕熱證的潰瘍性結(jié)腸炎患者于正常人之間的腸道菌群之間存在著菌群結(jié)構(gòu)的失調(diào)、腸道菌群的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了相應(yīng)的改變；但因?yàn)楸敬窝芯孔鳛槌醪教剿餍缘难芯浚瑯颖玖枯^低可能是導(dǎo)致本次研究與之前其他學(xué)者的研究存在一定的差異的原因。因此在今后的研究過程中，我們會(huì)進(jìn)一步的加大樣本量，進(jìn)行更加詳細(xì)的觀察與研究；通過高通量測(cè)序方法進(jìn)一步研究潰瘍性結(jié)腸炎不同證候之間腸道菌群的差異，分析在前期實(shí)驗(yàn)過程中存在的特異性菌群在大腸濕熱證潰瘍性結(jié)直腸炎中富集的真正原因以及其他相關(guān)菌群可能存在的潛在變化，為闡明UC大腸濕熱證的本質(zhì)提供微生態(tài)學(xué)依據(jù)并對(duì)臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎提供依據(jù)。