廣西特色壯藥金邊螞蟥抗痛風(fēng)活性成分研究＊

劉喜華，黃思詩(shī)，黃敏琪，熊萬(wàn)娜，周維海，甄漢深，劉安韜＊＊

（1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 南寧 530023；2.南寧市金?？瓶瞪镝t(yī)藥科技有限公司 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 南寧 530001）

金邊螞蟥系醫(yī)蛭科動(dòng)物菲牛蛭Poecilobdella ma?nillensis Lesson的干燥全體，為常用壯、瑤藥，中醫(yī)藥具有破血通經(jīng)、逐瘀消瘕之功，用于治療血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌打扭傷等，壯醫(yī)藥認(rèn)為其具有調(diào)龍路、散淤腫之功，用于京瑟（閉經(jīng)）、唄農(nóng)（癰瘡）、麻邦（中風(fēng)）、扭像（扭挫傷）[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，金邊螞蟥具有較強(qiáng)的抗凝血、抗血栓、抗血小板聚集、降血脂作用，廣西民間多應(yīng)用金邊螞蟥防治痛風(fēng)，筆者的前期研究也證實(shí)其具有良好的抗高尿酸痛風(fēng)作用[2]，但該藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制筆者還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用次黃嘌呤復(fù)制小鼠高尿酸血癥模型，二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳郭腫脹模型，熱板法、扭體法觀察金邊螞蟥提取物的藥理活性，為闡明其抗高尿酸血癥和抗痛風(fēng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床抗痛風(fēng)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

1.1.1 水提物和石油醚提取物的制備

分別取金邊螞蟥凍干粉（南寧市金海科康生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20160903）300 g，在常溫下分別加入蒸餾水及石油醚（分析純）溶液，浸泡48 h，滲濾得到續(xù)濾液，低溫?fù)]干既得。得到水提取物82.3 g，石油醚提取物28.4 g。實(shí)驗(yàn)時(shí)劑量換算成每克相當(dāng)于金邊螞蟥凍干粉劑量單位。

1.1.2 水蛭素及金邊螞蟥續(xù)濾粉的制備

取金邊螞蟥活體（南寧市德?tīng)I(yíng)生物科技科技有限公司，批號(hào)20170801），經(jīng)廣西科學(xué)院生物研究所周維官研究員鑒定為醫(yī)蛭科牛蛭屬動(dòng)物菲牛蛭（金邊螞蟥）Poecilobdella manillensis Lesson。將吸飽2%氯化鈉的金邊螞蟥活體置于容器中，加入一定量的硫酸鋅與乙醇的混合液使其吐出體內(nèi)的唾液，即天然水蛭素提取液，天然水蛭素提取液經(jīng)純化后加入輔料進(jìn)行冷凍干燥得到的粉末即為天然水蛭素產(chǎn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%，凝血酶滴定約5200 ATU/g），實(shí)驗(yàn)用水蛭素加入蒸餾水配成含水蛭素200 ATU/g溶液。提取水蛭素的金邊螞蟥粉末干燥后，得到金邊螞蟥續(xù)濾粉。

1.1.3 藥品與試劑

別嘌醇片（批號(hào)：319002），重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司；醋酸地塞米松片（批號(hào)：20100803），重慶西部制藥有限責(zé)任公司；羅通定片（批號(hào)：A090702），山西云鵬制藥有限公司生產(chǎn)；次黃嘌呤和尿酸，均為Sigma公司產(chǎn)品；尿酸試劑盒（批號(hào)：20170426），南寧建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2009-0003。

1.3 儀器

3960型iMark酶標(biāo)儀，Japan Bio-rad公司

2 方法

2.1 活性部位篩選

2.1.1 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響[3]

選取體質(zhì)量18-22 g昆明種小鼠100只，雄性，隨機(jī)分為10組，每組l0只，即對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性藥別嘌醇(0.01 g·kg-1)組，金邊螞蟥凍干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥水提物高、中、低劑量(2.00、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥石油醚提取物高、中、低劑量(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)。各組灌胃給藥，每天1次，對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)12 d。除對(duì)照組外，各組末次給藥 1 h后，腹腔注射次黃嘌呤600 mg·kg-1，1 h后眼球取血，3000 r·min-1離心10 min，取上清液測(cè)定血清尿酸水平(磷鎢酸比色法)。

2.1.2 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響[3]

取昆明小鼠90只，雄性，體重(20±2)g。隨機(jī)分為9組，每組l0只，即對(duì)照組，地塞米松組（0.005 g·kg-1），金邊螞蟥凍干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥水提物高、中、低劑量(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥石油醚提取物高、中、低劑量(2.0、1.0、0.5g·kg-1)。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥后1 h，在各小鼠左耳朵前后兩面均勻涂抹二甲苯，30 min后處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器（直徑8 mm）分別在同一部位打下耳片，稱重，計(jì)算腫脹度和抑制率，腫脹度以小鼠左右耳片重量之差來(lái)計(jì)算，腫脹率=(左耳重-右耳重)/右耳重。

2.1.3 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響[3]

（1）小鼠熱板痛閾的影響

取90只預(yù)先經(jīng)篩選的雌性小鼠(剔除痛閾值＜5 S或痛閾值＞30 S的小鼠)，隨機(jī)分成9組，即對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(羅通定，0.05 g·kg-1)，金邊螞蟥凍干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥水提物高、中、低劑量(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥石油醚提取物(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)。各組灌胃給藥給藥1次，對(duì)照組給予等量生理鹽水。各組于給藥后60 min采用熱板法檢測(cè)痛閾值。

（2）小鼠扭體反應(yīng)的影響

取昆明種小鼠90只，雄性，隨機(jī)分為9組，每組10只。分組、給藥方法同上。給藥后1 h，腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，5 min后，計(jì)數(shù)各小鼠10 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.2 活性成分篩選

2.2.1 金邊螞蟥不同組分對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響[3]

選取體質(zhì)量18～22 g昆明種小鼠90只，雄性，隨機(jī)分為9組，每組l0只，即對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性藥別嘌醇(0.01 g·kg-1)組，金邊螞蟥凍干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥活性成分（水蛭素）高、中、低劑量(2.00、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥續(xù)濾粉(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)。各組ig給藥，每天1次，對(duì)照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)12 d。除對(duì)照組外，各組末次給藥1 h后ip次黃嘌呤600 mg·kg-1，1 h后眼球取血，3000 r·min-1離心10 min，取上清液用磷鎢酸比色法測(cè)定血清尿酸水平。

2.2.2 金邊螞蟥不同組分對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響[3]

取昆明小鼠90只，雄性，體重(20±2)g。隨機(jī)分為9組，每組l0只，即對(duì)照組，地塞米松組（0.005 g·kg-1），金邊螞蟥干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥活性成分（水蛭素）高、中、低劑量(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥續(xù)濾粉(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥后1 h，在各小鼠左耳朵前后兩面均勻涂抹二甲苯，30 min后處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器（直徑8 mm）分別在同一部位打下耳片，稱重，計(jì)算腫脹度和抑制率，腫脹度以小鼠左右耳片重量之差來(lái)計(jì)算，腫脹率=(左耳重-右耳重)/右耳重。

2.2.3 金邊螞蟥不同組分對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響[3]

（1）對(duì)小鼠熱板痛閾的影響

將90只預(yù)先經(jīng)篩選的雌性小鼠(剔除痛閾值＜5 S或痛閾值＞30 S的小鼠)，隨機(jī)分成9組，即對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(羅通定，0.05 g·kg-1)，金邊螞蟥凍干粉（2.0 g·kg-1）組，金邊螞蟥金邊螞蟥活性成分（水蛭素）(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)組，金邊螞蟥續(xù)濾粉(2.0、1.0、0.5 g·kg-1)。各組灌胃給藥1次，對(duì)照組給予等量生理鹽水。給藥60 min后，采用熱板法檢測(cè)痛閾值。

（2）對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

取雄性小鼠90只，分組、給藥方法同（1）。每只小鼠給藥后1 h，腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，5 min后，開(kāi)始計(jì)各小鼠在10 min內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 活性組分篩選結(jié)果

3.1.1 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響

表1結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，模型組血清尿酸水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，別嘌醇0.01 g·kg-1，金邊螞蟥凍干粉2.0 g·kg-1，金邊螞蟥水提物2.0、1.0和0.5 g·kg-1可顯著降低血清尿酸水平（P＜0.01，P＜0.05），金邊螞蟥石油醚提取物各劑量對(duì)高尿酸小鼠血清尿酸水平無(wú)顯著影響。

3.1.2 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響

表2結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，地塞米松組0.005 g·kg-1，金邊螞蟥凍干粉2.0 g·kg-1，金邊螞蟥水提物2.0、1.0和0.5 g·kg-1可明抑制二甲苯引起的小鼠耳郭腫脹（P＜0.05），金邊螞蟥石油醚提取物各劑量對(duì)二甲苯引起的小鼠耳郭腫脹無(wú)顯著影響。

表1 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響（s,n=10）

表1 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響（s,n=10）

與模型組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

組別對(duì)照組模型組別嘌醇金邊螞蟥凍干粉金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物劑量/(g·kg-1)0.01 2.0 2.0 1.0 0.5 2.0 1.0 0.5尿酸/(umol·L-1)99.38±26.58**172.49±42.22 46.07±22.58**84.53±15.26**90.62±39.95**128.32±46.39*122.61±31.36**140.12±40.95 155.73±39.03 138.98±48.56

表2 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響（s,n=10）

表2 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響（s,n=10）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

抑制率/%-25.43 12.50 20.69 17.67 9.05 9.91 12.50 10.78組別對(duì)照組地塞米松金邊螞蟥凍干粉金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物劑量/(g·kg-1)-0.005 2.0 2.0 1.0 0.5 2.0 1.0 0.5腫脹度/mg 23.20±2.86 17.30±6.29**20.30±2.06*18.40±4.84*19.10±3.51*21.10±3.03*20.90±2.92 20.30±2.87 20.70±2.54

3.1.3 金邊螞蟥不同極性溶劑提取物對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響

表3結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，羅通定0.05 g·kg-1，金邊螞蟥凍干粉2.0 g·kg-1，金邊螞蟥水提物2.0 g·kg-1和1.0 g·kg-1可降低醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)（P＜0.01，P＜0.05），金邊螞蟥石油醚提取物各劑量對(duì)醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)無(wú)顯著影響。

3.2 活性成分篩選

3.2.1 金邊螞蟥金邊螞蟥不同組分對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響

表4結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，模型組血清尿酸顯著升高（P ＜ 0.01）；與模型組比較，別嘌醇0.01 g·kg-1，金邊螞蟥活性成分（水蛭素）0.8、0.4和0.2 g·kg-1，金邊螞蟥續(xù)濾粉2.0 g·kg-1和1.0 g·kg-1可降低血清尿酸水平（P＜0.01，P＜0.05）。

表3 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響（s,n=10）

表3 金邊螞蟥不同溶劑提取物對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響（s,n=10）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

2 h/s 22.70±3.025 51.80±10.44**32.00±14.16 38.40±11.10 30.70±12.28 30.70±12.47 29.50±11.80 29.00±11.62 29.60±12.46組別對(duì)照組羅通定金邊螞蟥凍干粉金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥水提物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物金邊螞蟥石油醚提取物劑量/(g·kg-1)0.005 2.0 2.0 1.0 0.5 2.0 1.0 0.5扭體次數(shù)/次23.30±4.88 11.30±5.58**16.20±6.39**15.10±6.26**17.20±6.43*19.30±6.29 19.50±6.08 19.10±6.52 19.40±5.78痛閾值1 h/s 23.00±4.88 50.70±12.21**30.10±11.54 30.90±10.98 30.60±11.61 28.80±12.22 29.70±11.06 28.70±11.80 27.50±5.40

表6 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響（s,n=10）

表6 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響（s,n=10）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

2 h/s 33.30±10.38 51.10±13.76**44.90±10.94 42.60±11.01 37.50±14.91 37.90±12.43 43.10±13.40 38.40±14.26 41.80±12.07組別對(duì)照組羅通定金邊螞蟥凍干粉水蛭素水蛭素水蛭素金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉劑量/(g·kg-1)-0.05 2.0 0.8 0.4 0.2 2.0 1.0 0.5扭體次數(shù)/次21.50±7.50 12.20±5.20**15.20±5.67*15.20±4.89*16.10±4.28 15.30±6.57 16.20±4.57 16.60±4.14 17.90±6.79痛閾值1 h/s 27.40±8.00 49.60±16.63**38.70±12.28 38.40±15.20 36.60±13.64 35.60±13.33 35.70±12.58 36.30±14.66 37.10±14.94

表4 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響（s,n=10）

表4 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸的影響（s,n=10）

與模型組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

尿酸/(Umol·L-1)126.63±27.61**232.73±50.93 61.23±29.84**169.99±46.07*140.70±25.97**149.07±39.28**177.59±38.59*176.45±44.43**183.30±51.09*219.42±41.68--組別對(duì)照組模型組別嘌醇金邊螞蟥凍干粉水蛭素水蛭素水蛭素金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉劑量/(g·kg-1)0.01 2.0 0.8 0.4 0.2 2.0 1.0 0.5

3.2.2 金邊螞蟥不同組分對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響

和對(duì)照組比較，地塞米松組0.005 g·kg-1，金邊螞蟥活性成分（水蛭素）0.8、0.4和0.2 g·kg-1，金邊螞蟥續(xù)濾粉2.0 g·kg-1可明顯抑制二甲苯引起小鼠耳郭腫脹（P ＜ 0.05）（表5）。

表5 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響（s,n=10）

表5 金邊螞蟥活性成分（水蛭素）對(duì)二甲苯引起小鼠耳郭腫脹的影響（s,n=10）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05,**P＜0.01

劑量/(g·kg-1)抑制率/%13.16 9.65 11.84 13.16 11.84 8.55 10.09 9.21組別對(duì)照組地塞米松金邊螞蟥凍干粉水蛭素水蛭素水蛭素金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉金邊螞蟥續(xù)濾粉0.005 2.0 0.8 0.4 0.2 2.0 1.0 0.5腫脹度/mg 22.80±2.86 19.80±1.14**20.60±1.90*20.10±2.18*19.80±2.57*20.10±1.66*20.85±1.60*20.50±2.27 20.70±1.77

3.2.3 金邊螞蟥不同組分對(duì)醋酸引起引起小鼠扭體反應(yīng)和熱板痛閾值的影響

表6結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，羅通定，0.05 g·kg-1，金邊螞蟥活性成分（水蛭素）0.8 g·kg-1，可明降低醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05），金邊螞蟥續(xù)濾粉各劑量對(duì)醋酸引起的小鼠扭體無(wú)明顯影響。

4 討論

尿酸是鳥(niǎo)類和爬行類動(dòng)物嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，嘌呤的代謝紊亂，導(dǎo)致高尿酸血癥發(fā)生。本病患病率受到多種因素的影響，與遺傳、性別、年齡、生活方式、飲食習(xí)慣、藥物治療和經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度等有關(guān)。尿酸是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，并與高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、胰島素抵抗、腎病、炎癥、感染性疾病的嚴(yán)重程度、腫瘤溶解綜合征、更年期綜合征、器官移植并發(fā)癥和某些疑難病癥（阻塞性睡眠呼吸暫停、原發(fā)性干燥綜合征等）的發(fā)生密切相關(guān)[4-6]，所以控制高尿酸血癥對(duì)治療痛風(fēng)及高尿酸血癥相關(guān)的疾病具有重要意義?；诮疬呂涹己玫目雇达L(fēng)作用且具有高效低毒等特點(diǎn)[2]，筆者試圖通過(guò)不同的藥理學(xué)方法探討其抗痛風(fēng)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究從大小兩頭極性溶劑（水、石油醚）提取金邊螞蟥篩選研究抗高尿酸痛風(fēng)作用的活性成分，結(jié)果表明，金邊螞蟥抗痛風(fēng)的主要活性部位是水溶性部位，其中水溶性成分水蛭素是主要的抗高尿酸痛風(fēng)作用的活性成分。由于加熱易破壞活性成分，金邊螞蟥提取時(shí)在常溫中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)提示，金邊螞蟥續(xù)濾粉由于提取水蛭素不完全，表現(xiàn)出抗高尿酸痛風(fēng)作用，提示可進(jìn)一步回收利用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水蛭素具有廣泛的藥理活性，在抗腫瘤[7]、心腦血管疾病[8]、腎臟[9]、關(guān)節(jié)炎[10]等方面都具有良好活性。但水蛭素在抗高尿酸、痛風(fēng)的藥理活性研究中，目前筆者未見(jiàn)國(guó)內(nèi)（外）報(bào)道，本研究證實(shí)了水蛭素新的應(yīng)用領(lǐng)域。

目前，臨床上用于抗高尿酸血癥的藥物主要涉及減少尿酸生成和增加尿酸排泄兩方面。近年來(lái)，人們?cè)谥参锼幖爸兴帍?fù)方中篩選出許多具有抗高尿酸血癥的藥物，為抗高尿酸血癥藥物的研究提供了研究基礎(chǔ)[11-12]。在動(dòng)物類藥物特別是昆蟲(chóng)類藥物中也篩選出一些具有研究?jī)r(jià)值的藥物，擬黑多刺蟻具有較好的抗高尿酸血癥的作用[13]。引起高尿酸的病理學(xué)基礎(chǔ)尚未完全闡明，對(duì)高尿酸的研究主要集中在尿酸的合成和尿酸的排泄謝兩個(gè)方面，影響尿酸合成的靶點(diǎn)主要為尿酸合成的關(guān)鍵酶-黃嘌呤氧化酶[14]，影響尿酸排泄主要關(guān)注腎臟小管的尿酸轉(zhuǎn)移因子Glud、OAT等[15,16]。金邊螞蟥及其活性成分抗高尿酸作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。