甘草顏色與HPLC指紋圖譜信息相關(guān)性研究＊

陳慧榮，林相龍，楊瑞琦，曹光昭，閆永紅＊＊，鄒慧琴＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2.北京寶德潤(rùn)生醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司 北京 100088）

傳統(tǒng)性狀鑒別是中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效方法，其中顏色是質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，與其品質(zhì)密切相關(guān)。如甘草自古以來以外皮紅棕色、斷面黃白色為佳，《本草經(jīng)集注》稱“赤皮斷理，看之堅(jiān)實(shí)者……最佳”[1]，《新編中藥志》載“皮細(xì)緊、色紅棕、斷面黃白色、粉性足者為佳”[2]。顏色對(duì)甘草質(zhì)量的鑒別至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)性狀鑒定法的感官顏色存在主觀性強(qiáng)、描述模糊等局限性，缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)。

色度學(xué)是研究人的顏色視覺規(guī)律、顏色測(cè)量的理論和技術(shù)的一門學(xué)科，在中藥領(lǐng)域的運(yùn)用能使中藥顏色描述實(shí)現(xiàn)客觀化、規(guī)范化。國(guó)際發(fā)光照明委員會(huì)（CIE）色度學(xué)系統(tǒng)以3色原理為基礎(chǔ)，即任何一個(gè)顏色，都能用線性無關(guān)的3個(gè)原色適當(dāng)?shù)南嗉踊旌吓c之匹配。三原色可任意選定，但其中的任何一種原色均不可由其他兩種原色相加混合得到。與待測(cè)顏色達(dá)到匹配時(shí)所需要的三原色的數(shù)量，稱為三刺激值。本實(shí)驗(yàn)采用的是目前應(yīng)用較為廣泛的CIE1976L*a*b均色空間系統(tǒng)[3-5]，其中，明度L*、色度a*和b*三個(gè)坐標(biāo)軸互相垂直。L*表示明度，明度越大，越偏白；明度越小，越偏黑；a*和b*表示不同的色調(diào)方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向；+b*表示黃方向，-b*表示藍(lán)方向。

課題組前期研究，摸索并建立了甘草表面、斷面顏色數(shù)字化的測(cè)量方法[6]，本研究在此基礎(chǔ)上，采用色度學(xué)技術(shù)將甘草顏色客觀化，并對(duì)其進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析，探索整體化學(xué)成分質(zhì)量與顏色的相關(guān)性。為將色度測(cè)定方法推廣應(yīng)用于其他藥材的顏色測(cè)量提供理論依據(jù)，完善中藥性狀鑒別，推動(dòng)傳統(tǒng)學(xué)科發(fā)展創(chuàng)新。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

收集來自甘肅西部地區(qū)、內(nèi)蒙古杭錦旗、通遼、赤峰地區(qū)野生及栽培甘草樣品共34份，所有樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定，確定為甘草（烏拉爾甘草）Glycyrrhiza uralensis Fisch.，樣品編號(hào)見表1。

1.2 儀器

ZN-02小型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）；U-3010紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀，四元泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，Agilent 1100色譜工作站；DIKMA Platisil ODS色譜柱（5 μm，250×4.6 mm）；0.45 μm針筒式微孔濾膜過濾器；BP211D型1/100000電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

表1 收集的野生及栽培甘草樣品基本信息

1.3 試劑

乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；甲醇、磷酸等為分析純（北京化工廠）；水為屈臣氏純凈水；甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品（供含量測(cè)定用，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207，中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)110731-200615）、甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號(hào)111610-201005）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 甘草斷面顏色測(cè)量方法[7]

2.1.1 樣品制備

將甘草切成長(zhǎng)約2 cm的小段，對(duì)甘草段施以壓力，令表皮脫落，將去皮的甘草段打粉，過3號(hào)篩，粉末置于自制玻璃測(cè)色皿中，蓋上石英鏡片，以測(cè)色皿中粉末不隨意晃動(dòng)為準(zhǔn)。

2.1.2 顏色測(cè)定條件

采用日立3010紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量起止波長(zhǎng)：380-780 nm；狹縫寬度：1 nm；照明光源：D65；視場(chǎng)選擇：10度視角；掃描速度：600 nm·min-1。

2.1.3 精密度考察

取杭錦旗野生樣品，按上述供試品制備方法制備供試品，連續(xù)測(cè)量5次。測(cè)量結(jié)果RSD均小于3%，結(jié)果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.09，色差低于人眼可變范圍。表明結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性考察

隨機(jī)取杭錦旗野生樣品5份，按上述供試品制備方法制備供試品，分別進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量結(jié)果顯示RSD均小于3%，結(jié)果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可變辨范圍。表明結(jié)果穩(wěn)定。

2.2 HPLC指紋圖譜方法的建立[8]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取甘草酸銨及甘草苷對(duì)照品，加入提取液（甲醇：5%氨水=80∶20），制成每1 mL含甘草酸0.2 mg、甘草苷0.2 mg的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

將各甘草樣品粉碎，過3號(hào)篩。精密稱取0.1g于25 mL量瓶中，加入約25 mL提取液（甲醇：5%氨水＝80∶20），冷浸24 h。超聲提取30 min（功率50 kw），放冷至室溫，加提取液至刻度，搖勻后過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 色譜條件

流動(dòng)相A：0.1%磷酸水（每500 mL含7滴THF），流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫條件及檢測(cè)波長(zhǎng)見表2。流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為15 μL，柱溫24℃，檢測(cè)時(shí)間為50 min。

按照按上述確定的供試品、對(duì)照品制備方法及測(cè)試條件進(jìn)行樣品分析（圖1、2、3）。

2.2.4 精密度考察

取甘草酸含量相對(duì)較高的杭錦旗野生甘草樣品為供試品。按供試品制備方法制備1份，以上述選定方法連續(xù)進(jìn)樣5次，考察方法精密度（圖4）。

比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個(gè)色譜峰的保留時(shí)間、峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，色譜峰保留時(shí)間的RSD為0.05-0.08%，峰面積的RSD為0.14-0.51%。樣品圖譜經(jīng)國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)匹配，不經(jīng)多點(diǎn)校正，相似度在0.998-1.000之間（不包括自身比較），該方法精密度良好。

2.2.5 重現(xiàn)性考察

取杭錦旗野生甘草樣品5份，按供試品制備方法提取，以上述選定方法依次進(jìn)樣各一次，扣除稱樣量差別（稱樣量盡量接近），考察方法重現(xiàn)性。比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個(gè)色譜峰保留時(shí)間、峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，色譜峰保留時(shí)間的RSD為0.19-0.2%，峰面積的RSD為1-2.25%，相似度在0.986-0.999之間（不包括自身比較），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察

用考察精密度的同一樣品，分別在0，2，4，6，8，12，16，24，36，48 h進(jìn)樣，考察方法穩(wěn)定性（樣品于室溫放置）。比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個(gè)色譜峰的保留時(shí)間、峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，相似度在0.997-1.000之間（不包括自身比較），表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘草斷面顏色測(cè)量結(jié)果

對(duì)34批甘草樣品分別進(jìn)行斷面顏色值的測(cè)量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三遍，記錄顏色指標(biāo)的平均值，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)選擇L*a*b*色空間中L*、a*、b*的值作為顏色測(cè)量指標(biāo)。

3.2 甘草樣品HPLC指紋圖譜測(cè)定結(jié)果

將所有栽培甘草樣品指紋圖譜進(jìn)行疊加，用色譜指紋圖譜相似度軟件對(duì)其進(jìn)行分析，得到了甘草栽培品HPLC對(duì)照指紋圖譜，見圖5，共計(jì)74個(gè)色譜峰，其中共有峰20個(gè)，占總面積的92%；通過對(duì)所有甘草野生指紋圖譜進(jìn)行分析，得到了野生甘草HPLC對(duì)照指紋圖譜，見圖6，經(jīng)相似度軟件分析匹配后，共給出79個(gè)色譜峰，其中共有峰17個(gè)，占總面積91%，見表4。

表2 甘草HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相梯度條件及檢測(cè)波長(zhǎng)

圖1 甘草對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 甘草栽培樣品HPLC色譜圖

圖3 甘草野生品HPLC色譜圖

圖4 精密度考察

表3 甘草斷面顏色測(cè)量指標(biāo)值

表4 甘草HPLC指紋圖譜共有峰保留時(shí)間

結(jié)合表4和圖5及6可以看出，栽培甘草和野生甘草的HPLC指紋圖譜中大多數(shù)指紋峰的峰形、保留時(shí)間基本一致，差異主要集中在40 min之后的18、19、20號(hào)峰。

結(jié)合文獻(xiàn)[8]以及上述色譜圖可知色譜圖前段23 min以前以二氫黃酮苷、查爾酮苷和黃酮苷類成分為主，時(shí)間中段25 min到35 min以五環(huán)三萜類皂苷成分為主，40分鐘之后以香豆素類和黃酮類為主。以此為據(jù)，初步將1-10號(hào)峰劃為一組，其以黃酮苷類成分為主；將11-17號(hào)峰劃為一組，其以三萜皂苷類成分為主；將18-20號(hào)峰劃為一組，其以香豆素類成分為主。按照上述分類對(duì)34份甘草樣品進(jìn)行總結(jié)。

圖5 栽培甘草HPLC對(duì)照指紋圖譜

圖6 野生甘草HPLC對(duì)照指紋圖譜

以各指紋圖譜中測(cè)得的甘草酸峰面積為1，計(jì)算各樣品圖譜中色譜峰的峰面積比值，求得三部分的相對(duì)峰面積和，結(jié)果見表5。

3.3 甘草斷面顏色指標(biāo)值與HPLC指紋圖譜信息的典型相關(guān)分析

甘草樣品顏色指標(biāo)值L*、a*、b*與HPLC指紋圖譜三組色譜峰相對(duì)峰面積和為兩組連續(xù)變量，且經(jīng)過主成分檢驗(yàn)法均符合多元正態(tài)分布[9]，符合典型相關(guān)分析的條件。運(yùn)用SAS9.4對(duì)34份甘草樣品斷面顏色指標(biāo)值L*、a*、b*與HPLC指紋圖譜三組色譜峰相對(duì)峰面積和做典型相關(guān)分析，得到3對(duì)典型變量（見表6）。典型相關(guān)系數(shù)用似然比法檢驗(yàn)與0是否有顯著差異，結(jié)果顯示，第1、2典型相關(guān)系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第1、2典型相關(guān)系數(shù)分別為0.787035和0.603669，特征值的貢獻(xiàn)率分別為73.67%，25.95%，前兩對(duì)變量的累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)99.62%。結(jié)果表明甘草斷面顏色與HPLC指紋圖譜有顯著相關(guān)性。

4 討論

在對(duì)中藥材的質(zhì)量控制上，多年來一直是通過對(duì)有效成分或指標(biāo)性成分的含量測(cè)定來檢測(cè)。目前有關(guān)甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)的報(bào)道很多，主要以用HPLC測(cè)定甘草酸、甘草苷等指標(biāo)成分為主[10-14]。

表5 甘草三組色譜峰相對(duì)峰面積和

盡管以化學(xué)成分作為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)更直觀，但這種方法需要滿足兩個(gè)前提，一是中藥材中所測(cè)得的的確是有效成分；二是所含的有效成分或指標(biāo)成分的含量與所有有效成分的含量比是固定的。但是每一味中藥材中都含有多種成分，是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，不同的有效成分以及有效成分不同的含量比例使每一味中藥材看起來更像一個(gè)中醫(yī)復(fù)方。因此，經(jīng)過幾千年臨床驗(yàn)證而總結(jié)的傳統(tǒng)藥材性狀仍具有很高的價(jià)值。

中藥色澤是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)之一，越來越多的學(xué)者關(guān)注了中藥及中藥飲片的顏色測(cè)量。鄒慧琴等[7]基于色度學(xué)理論建立了甘草斷面及表皮顏色指標(biāo)數(shù)字化的方法；熊吟等[15]使用色度計(jì)對(duì)金銀花粉末進(jìn)行測(cè)量，并結(jié)合藥材內(nèi)部物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果金銀花顏色值與所含總黃酮含量相關(guān)；謝晉等[16]發(fā)現(xiàn)丹皮飲片斷面的顏色b*值與飲片中所含丹皮酚的含量存在穩(wěn)定的相關(guān)性。

表6 甘草斷面顏色與HPLC指紋圖譜的典型相關(guān)分析

通過中藥外觀色澤的客觀量化，有望建立一套具有中醫(yī)藥特色的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為中藥現(xiàn)代化提供新思路。然而中藥飲片大多形態(tài)體積不一、表面粗糙不平，需要對(duì)測(cè)量面進(jìn)行預(yù)處理，使色度測(cè)量具有一定困難。另外，對(duì)中藥的人為染色也是中藥“辯色論質(zhì)”的新挑戰(zhàn)[5]。