正交試驗法優(yōu)化參芪解郁處方提取工藝＊

曲 淼，唐啟盛

（北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 北京 100029）

參芪解郁方是由北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院唐啟盛教授臨床治療產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression,PPD）的經(jīng)驗方，由黃芪、黨參、陳皮等組成，具有補益心脾，頤腦醒神的功效[1]。

PPD作為一種嚴重影響母嬰身心健康的精神情緒障礙性疾病，近年來發(fā)病率逐年升高，已成為臨床中的常見病、多發(fā)病。PPD起病隱匿，發(fā)病率高，常共病焦慮或其他精神障礙性疾病，再次妊娠的復發(fā)率高達50%，嚴重者可出現(xiàn)傷嬰或自殺行為，給家庭和社會造成嚴重的影響?，F(xiàn)已證實PPD發(fā)病與機體神經(jīng)、生殖、內分泌、免疫系統(tǒng)相關，因其確切生物學發(fā)病機制仍不甚明確，故為本病的防治帶來較大困難。

目前，用于臨床治療本病的常用西藥包括抗抑郁藥、鎮(zhèn)靜催眠藥和抗焦慮藥等，這些藥物雖各有其優(yōu)勢，但存在服藥后影響產(chǎn)婦哺乳及藥物可通過乳汁對嬰兒產(chǎn)生不良影響等諸多問題，使得絕大多數(shù)患者和家屬不愿接受治療。

由于該方不影響產(chǎn)婦哺乳的獨特優(yōu)勢，對PPD的治療發(fā)揮重要作用。

前期臨床研究已表明[2-4]，參芪解郁方可顯著改善PPD患者的愛丁堡產(chǎn)后抑郁量表（Edinburgh Postnatal Depression Scale，EPDS）評分和中醫(yī)證候評分，顯著降低血清孕酮水平，提升血清雌二醇水平，有效緩解抑郁癥狀，且起效快、副作用小，療效持久穩(wěn)定。本實驗將對參芪解郁方的分析方法以及煎煮工藝進行探索，篩選出參芪解郁處方的最佳提取工藝，為進一步優(yōu)化制備工藝提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters e 2695高效液相色譜儀（包括Waters e 2695分離單元、四元泵、自動進樣器、Waters 2998二極管陣列檢測器、Waters ELSD 2424蒸發(fā)光散射檢測器、Empower3色譜工作站，美國Waters公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100W，頻率：40kHz）；AB-135S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DIT-DX型數(shù)顯恒溫電熱套（鄭州長城科工貿易有限公司）。

圖1 對照品標準曲線

圖2 陰性樣品1色譜圖

圖3 陰性樣品2色譜圖

圖4 橙皮苷對照品色譜圖

1.2 試藥

飲片藥材、顆粒劑均購自北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，黃芪（批號：16017001）、黨參（批號：16020641）、炒酸棗仁（批號：16019351）、酒萸肉（批號：16017841）、郁金（批號：16017841）、陳皮（批號：16018201）、佛手（批號：16013901）、當歸（批號：16020081），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定，藥材均為2015版《中國藥典》的收載品種，經(jīng)檢驗均符合2015版《中國藥典》含量測定項下要求。橙皮苷對照品（貨號：ST01300120MG）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司，純度＞98%。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonisl C18柱（250 nm×4.6 nm，5 μm），流動相為乙腈-水（20∶80），檢測波長為283 nm，柱溫25℃，流速為1.0 mL ·min-1，進樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計算應＞2000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷標準品4.15 mg置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度線，混勻，得0.166 mg·mL-1對照品溶液，配置好的對照品溶液用密封膜封好后，置于4℃冰箱中冷藏，備用。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 陳皮藥材供試品溶液的制備

稱取陳皮10 g，置50 mL量瓶中，加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲處理（功率：100 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2 參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑供試品溶液的制備

稱取黃芪20 g，黨參12 g，炒棗仁15 g，山萸肉15 g，郁金15 g，陳皮10 g，佛手10 g，當歸10 g，加10倍量水（約1070 mL）煎煮2次，每次微沸1小時，合并煎液，濃縮，用300目尼龍紗布過濾，定容至1000 mL，搖勻，取上訴制得溶液，過濾，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 復方顆粒供試品溶液的制備

取適量顆粒劑，研成細粉，精密稱取10 g，置50 mL量瓶中，加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲處理（功率：100 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 陰性樣品的制備

按傳統(tǒng)湯劑的制備方法不加入陳皮，制得陰性樣品1；按傳統(tǒng)湯劑的制備方法不加入陳皮、佛手制得陰性樣品2。

2.4 系統(tǒng)適應性試驗

橙皮苷對照品溶液，陳皮藥材、傳統(tǒng)湯劑、顆粒劑供試品溶液各進樣10 μL，按2.1項下色譜條件進行測定。結果表明，系統(tǒng)適應性良好。

表1 橙皮苷對照品精密度實驗峰面積與保留時間

表2 參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑供試品穩(wěn)定性實驗峰面積與保留時間

表3 參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑供試品重復性實驗峰面積與保留時間

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線的繪制

取適量以上制得橙皮苷對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分別以3 μL、5 μL、10 μL、13 μL、20 μL、25 μL進樣，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到橙皮苷回歸方程Y=271767X-112090，線性相關系數(shù)R2=0.9992，表明橙皮苷在0.041-0.413 μg范圍內線性關系良好。

2.5.2 專屬性實驗

精密吸取橙皮苷對照品溶液、陰性樣品1、陰性樣品2，按2.1項下色譜條件進樣測定，檢測兩個陰性樣品和對照品對應的色譜峰，結果陰性樣品1、陰性樣品2均沒有與對照品相同的色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.5.3 精密度實驗

精密吸取橙皮苷對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積值、保留時間，結果如下表所示，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實驗

精密吸取參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h，按2.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積值、保留時間，實驗結果如下表所示，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.5.5 重復性實驗

精密稱取同一批參芪解郁方飲片，按2.3.2項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積值、保留時間，結果如下圖所示，表明該方法重復性良好。

表4 參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑中橙皮苷含量測定的加樣回收率實驗

2.5.6 加樣回收率實驗

精密量取已知含量的參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑供試品溶液3 mL，于10 mL容量瓶中，共6份，各加入新配置一定含量對照品溶液3 mL，定容，搖勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積值，計算回收率，結果見表4。

2.6 正交試驗優(yōu)化參芪解郁處方提取工藝

2.6.1 正交試驗設計

參芪解郁方為基本方，以煎煮次數(shù)（A）、煎煮時間（B）、加水量（C）為考察因素，每個因素選3個水平，按正交表L9（34）的9個試驗號進行煎煮，以橙皮苷提取量為指標，優(yōu)選最佳煎煮的條件。因素水平見表5，正交試驗結果見表6，方差分析結果見表7。

2.6.2 結果分析

由表5、表6、表7可知，各因素對橙皮苷含量的影響為A＞B＞C，煎煮次數(shù)對提取工藝有顯著性影響，其余兩個因素影響并不顯著。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到的結果，A因素要選擇A3，可以使提取效果最大化，B、C因素影響較小，同時考慮對實際生產(chǎn)的影響，節(jié)水節(jié)能，節(jié)省時間，綜合考慮以上因素，最終選擇A3B1C1工藝，即煎煮次數(shù)：3次，煎煮時間0.5 h，水量：7倍。

表5 因素水平

表6 正交試驗結果

表7 方差分析結果

2.6.3 驗證試驗

將參芪解郁方按上述正交試驗所得到的最佳工藝（A3B1C1）提取3批藥材，按前述色譜條件檢測，記錄峰面積值，測定煎劑中橙皮苷含量如表8，結果表明此工藝穩(wěn)定可靠，可性。

2.7 樣品含量測定

分別按2.3項下方法制備陳皮藥材、參芪解郁方傳統(tǒng)湯劑、復方顆粒劑供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果如下表。

3 討論

測定成分的選擇：由于本方黃芪中黃芪甲苷、酸棗仁中酸棗仁皂苷A、當歸中阿魏酸的含量都比較低，不宜測量其含量。陳皮具有理氣調中，健脾解郁的功效，與黨參，黃芪同用，用于治療肝郁氣滯、心脾兩虛所致的抑郁癥，在組方中作用顯著。且陳皮中橙皮苷含量較高，因此選為指標性成分，但由于陳皮和佛手中都含有橙皮苷，盡管查閱2015版藥典得知佛手中橙皮苷含量較低，專屬性試驗還是做了兩組陰性對照（不含陳皮、不含陳皮和佛手），結果發(fā)現(xiàn)佛手對于此方法測定橙皮苷含量并沒有影響。

表8 驗證試驗結果

表9 樣品含量測定結果

提取溶劑的選擇：橙皮苷在水中以及甲醇中溶解度均較小，但甲醇略大于水，因此選用甲醇作為對照品、陳皮藥材的溶劑。水為傳統(tǒng)湯劑的提取溶劑，與臨床實際使用一致，使試驗結果更具有現(xiàn)實意義。

流動相的選擇：2015版藥典選用的是甲醇-冰醋酸-水作為流動相，由于含有酸的流動相在使用過程中會對儀器，色譜柱造成損傷，操作較為繁瑣，比較物質的極性后，選用了較為安全的乙腈-水作為流動相。

檢測波長的選擇：預實驗還分析了在267 nm，269 nm，280 nm，283 nm橙皮苷色譜峰的強度，結果發(fā)現(xiàn)283 nm下檢測最強，因此選定283 nm作為檢測波長。

考慮到藥材的浸泡時間會影響到提取的含量，因此9組藥材幾乎同時加水，同時提取，先大火加熱，煮至沸騰開始計時，調至小火微沸，每個蒸餾瓶盡量保持微沸的程度一樣，以減小試驗誤差。提取方法的選擇還要考慮到提取成本的因素，包括溶劑的用量，能源的使用，人工的費用，所以在保證提取率的情況下，爭取做到節(jié)能減排，綠色煎藥。

雖然得出加水量、煎煮時間因素對本實驗的影響因子較小，可能是由于設置的水平范圍過窄，而且與橙皮苷在水中的溶解度也有著一定的關系，溶解度過小，導致濃度變化范圍并不明顯，日常生活經(jīng)驗中認為，煎煮的時間越長，提取出來的成分也多，然而并不是這樣，煎煮時間過長，可能會導致一些有效成分發(fā)生揮發(fā)、氧化、水解、聚合等物理化學變化，從而影響藥物的療效，一些患者不按照醫(yī)囑的方法煎煮藥物，也是中藥臨床療效參差不齊的重要原因。

一般藥材的煎煮次數(shù)為兩次，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，此方煎煮三次可以提取出更多的有效成分，且增加量較多，有現(xiàn)實意義，打破了人們的思維定律，針對每一個方子，都應該有其規(guī)定的煎煮方法，希望中醫(yī)藥未來的發(fā)展可以更加規(guī)范化。