當歸芍藥散活性成分治療阿爾茲海默病作用機制的生物網絡分析＊

宋禎彥，陳易璇，余婧萍，成紹武

（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室 長沙 410208）

1 前言

阿爾茲海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病。據報道平均每33秒就有一名新的AD患者產生，截止到2016年，全球有超過7000萬人患有AD[1]。AD主要以存在不溶性β淀粉樣斑塊,神經原纖維纏結和神經元的損失為病理特征[2]。臨床上AD表現為漸進性記憶喪失和認知能力的逐漸衰退。目前臨床治療雖然部分有效地減少了適度的癥狀，但沒有任何藥物可以阻止AD病程的發(fā)展[3]?？紤]到AD是一個多因素、多途徑引發(fā)的疾病，單一療法作用單一靶點的治療原則是不合適的，而中醫(yī)的整體觀在多組分多靶點治療方面的經驗為防治AD提供了光明的前景。

當歸芍藥散（Danggui Shaoyao San，DSS）出自《金匱要略》，由當歸、芍藥、川芎、白術、澤瀉、茯苓六味中藥所組成，具有養(yǎng)血調肝，健脾利濕，活血化瘀，化痰通絡的功效。日本學者首先發(fā)現DSS能改善AD患者的運動障礙和認知功能下降[4]，隨后大量研究證明DSS對AD確實有一定的治療作用，如能明顯改善Aβ誘導的海馬CAl區(qū)LTP抑制[5]，提高海馬齒狀回膽堿能陽性神經纖維的數量和海馬突觸數量，改善突觸后終末結構[6]，抑制海馬區(qū)Aβ的沉積和神經炎癥[7]，同時還能改善多種癡呆模型動物的學習記憶能力[6,8]等。但對于DSS治療AD的研究都局限于某一個生物學功能，很難從系統(tǒng)層面上深入探索其作用機制。

網絡藥理學作為一個新興的藥理學研究領域，強調了“多成分，多靶點治療網絡”的概念，突出了中醫(yī)整體的思想，它為研究中醫(yī)藥治療AD的多靶點作用機制提供了新的思路。本文利用網絡藥理學方法分析了DSS防治AD的作用機制，首先從TCMSP數據庫篩選獲得中藥方劑DSS的有效成分并對有效成分進行靶點預測，其次利用網絡藥理學分析化合物-靶點的相互作用，建立了化合物-靶點網絡和化合物-靶點-AD網絡，最后，運用生物信息學分析方法闡明了DSS防治AD的多靶點多途徑作用機制（如圖1）。

2 材料與方法

2.1 當歸芍藥散中活性化合物數據庫建立

本文利用TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/）收集和下載當歸芍藥散中所有化合物，進行藥物分子藥動學性質（ADME，即吸收、分布、代謝、排泄）的預測和分析，篩選獲得符合條件的活性化合物：第一，當歸芍藥散作為中藥方劑，湯劑以口服作為主要服藥形式，因此設置了口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件之一[9]；第二，中樞神經系統(tǒng)的靶向藥物必須通過血腦屏障才能產生藥效作用，因此設置了血腦屏障滲透性（BBB）≥-0.3為篩選參數[10]；第三，類藥性（DL）是與生物活性同等重要的性質，對于口服藥物來說，達到作用靶點需要經過體內較多的生物學過程，具有較高的類藥性的化合物才能被安全送達靶器官、靶細胞發(fā)揮其生物學效應，因此設定了DL≥0.1為篩選條件[11]。

2.2 靶點預測

為了獲得DSS活性化合物的靶點，本文采用文獻挖掘技術、數據庫檢索和化學計量學分析等方法整合藥物活性化合物的靶點信息。首先，在TCMSP中搜索藥物活性化合物信息，初步得到活性化合物的靶點信息；第二，根據活性化合物配體之間的化學相似性，在SEA（http://sea.bkslab.org）和 the Binding Database（http://www.bindingdb.org）中查找，補充靶點。第三，利用UniProt（http://www.uniprot.org/）將靶點名稱進行標準化命名，匯總活性化合物的靶點數據。

2.3 網絡關系圖建立

為直觀展示藥物、化合物、靶點、疾病之間的相互關系，以及藥物作用的靶點定位，本文利用Cyto?scape_v3.4.0[12]建立網絡關系圖。可視化網絡由節(jié)點（node）和邊（edge）組成，節(jié)點代表分子（藥物、靶點和化合物），邊則表示節(jié)點之間的聯(lián)系（即藥物、化合物和靶點間的交互關系）。

2.3.1 藥物-化合物-靶點網絡

圖1 DSS治療AD的網絡藥理學分析工作流程圖

當歸芍藥散由當歸、芍藥、川芎、白術、澤瀉、茯苓六味中藥所組成，在TCMSP中篩選得到每種藥物對應的活性化合物，并通過靶點預測獲得各活性化合物對應的靶基因，利用CytoScape_v3.4.0建立“藥物-化合物-靶點”（Herb-Compound-Target，H-C-T）網絡。

2.3.2 藥物-靶點-AD網絡

DisGeNET數據庫（http://www.disgenet.org/）整合了大量與人類疾病相關的基因和蛋白靶點數據，最新版本共包含561119個疾病與基因的聯(lián)系和135588種疾病與表型的聯(lián)系[13]。為了闡明當歸芍藥散在AD中的作用，本文在DisGeNET5.0中搜索與AD相關的靶點，并篩選出當歸芍藥散作用靶點與AD相關性基因的重合部分，利用CytoScape_v3.4.0建立AD相關性“化合物-靶點-AD”（Compound-Target-AD，C-T-AD）網絡。

2.3.3 靶點-器官定位網絡

BioGPS是一個查詢和搜索目的基因注釋信息的數據庫，通過微陣列分析，可以提供細胞或組織中的基因表達豐度數據[14]。本文利用GeneAtlas U133A,gcrma（http://biogps.org）數據集建立靶點-器官定位網絡。首先，獲得每個靶基因在人體84個器官組織中的mRNA表達水平，并計算各靶基因mRNA在器官中平均表達水平；然后，篩選出mRNA表達水平高于平均水平的器官或組織，作為該靶基因所定位器官或組織；最后，以心、肝、肺、腎、全腦、全血為主要定位器官，利用Cyto?scape_v3.4.0構建特異性靶點-器官定位網絡。

2.4 GO功能富集分析

GO（Gene Ontology）是一個生物信息學分析模型，定義用于描述基因功能的基因類以及這些概念之間的關系，包括細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物學過程（Biological Process，BP）三個部分[15]。根據基因的GO注釋，以人類基因為背景，以P＜0.01，Benjamini＜0.05為條件，利用DAVID 6.8基因功能分類工具（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）對DSS中收集的與AD相關的靶基因進行GO富集分析。

2.5 Pathway富集分析

在生物體內，不同基因相互協(xié)調行使其生物學功能，基于Pathway的分析有助于更進一步了解基因的生物學功能。本文以P＜0.01，FDR≤0.05為條件篩選數據[16]，并運用OmicShare（www.omicshare.com/tools）進行了Pathway富集分析。同時為了闡明當歸芍藥散治療AD的作用機制，篩選出的靶基因被輸入到AD-path?way通路圖（KEGG號：map05010）中獲得信號通路富集分析圖。

3 結果

3.1 活性化合物鑒定

從TCMSP中收集DSS方劑中六味中藥的化合物，其中當歸有125種，芍藥85種，川芎189種，白術55種，澤瀉46種，茯苓34種，以OB≥30%，BBB≥-0.3，DL≥0.1為條件最終篩選出DSS的活性化合物51種，當歸芍藥散活性化合物信息見表1。

3.2 靶點預測

根據材料與方法2.2中所述，51種活性化合物中M28和M49沒有預測靶點，剩下49種活性化合物共預測靶點377個，其中不同化合物可作用于相同的靶點，同一靶點也可能來自不同化合物，平均一種活性化合物對應約24個靶點，這也充分印證了當歸芍藥散的多靶點作用。與DisGeNET數據庫中所獲得的2245個AD相關性基因進行比較，377個預測靶點中有197個潛在的重合靶點，本文認為這197個靶點與DSS防治AD密切相關。

3.3 網絡關系圖

3.3.1 藥物-化合物-靶點網絡圖

DSS中6種藥物、49種活性化合物與377個靶點之間的相互作用關系以藥物-化合物-靶點網絡（Herbs-Compounds-Targets，H-C-T）網絡的形式呈現（如圖2）。該網絡由434個節(jié)點和1210條邊組成，其中圓形節(jié)點表示藥物，六邊形節(jié)點表示化合物，長方形節(jié)點表示靶點，圍繞同一圓形節(jié)點的同色化合物表示屬于同種藥物，M19來源于當歸和白芍，M43來源于白芍、川芎和澤瀉。位于外圈的233個靶點與至少2個以上化合物連接，內圈的靶點則與更多的化合物相連。51個活性化合物中，22種化合物都具有20個以上的作用靶點，提示這些成分可能在DSS藥效中起主要作用。如H-C-T網絡圖顯示，其中圓形節(jié)點表示藥物，六邊形節(jié)點表示化合物，菱形節(jié)點表示靶點，圍繞同一圓形節(jié)點的同色化合物表示屬于同種藥物，其中M19來源于當歸、白芍，M43來源于白芍、川芎、澤瀉。

3.3.2 “化合物-靶點-AD”網絡圖

“化合物-靶點-疾病”網絡圖提供了一種將化合物、靶點映射到人類疾病中，建立疾病相關基因與活性化合物相互關系可視化網絡，直觀顯示疾病-化合物-靶點之間關系的方法。本文通過DisGeNET數據庫獲得與AD有關的197個潛在靶點，并與49個活性化合物建立AD相關性基因“C-T-AD”網絡圖（如圖3）。所有化合物都與至少2個靶點相連，從圖中可以看出ole?ic acid（M38，Degree=76）、EIC（M27，Degree=57）、DBP（M23，Degree=57）、beta-sitosterol（M19，Degree=41）、Methyl linolelaidate（M36，Degree=41）、METHYL LINO?LEATE（M35，Degree=41）、Exceparl M-OL（M29，De?gree=41）、Mandenol（M34，Degree=37）、DIBP（M25，De?gree=27）的自由度較高，說明這幾種化合物在AD治療中有更加重要的作用。同時，197個潛在靶點中有117個靶點與至少2個化合物相連，其中PTGS2（Degree=26）、GABBR1（Degree=20）、CHRM2（Degree=19）、CHRM1（Degree=19）、RXRA（Degree=16）、PTGS1（De?gree=13）、CHRNA7（Degree=11）具有高于 10的自由度，自由度越高，說明其參與網絡中的生物功能越多，其生物學重要性越強，提示這7個靶點與AD治療密切相關。

表1 當歸芍藥散51種活性化合物信息

圖2 草藥-化合物-靶點網絡圖

3.4 多靶點/多器官協(xié)作治療AD的作用機制

3.4.1 靶基因-器官定位

圖3 化合物-靶點-AD網絡圖

為闡明DSS藥物作用途徑和藥物主要的靶器官，本文將獲得的197個與AD相關性基因進行靶器官定位，并運用Cytoscape_v3.4.0建立AD相關性基因靶器官定位圖（見表2，圖4），發(fā)現有大量基因定位于肝臟、血液、心臟，腦，也是DSS治療AD藥效作用的重要靶器官。

3.4.2 GO功能富集分析

本文對197個與AD相關的靶點進行GOBP富集分析，選擇最相關的20個生物學過程進行展示（見表3），結果表明DSS治療AD的作用途徑主要與對藥物的反應、信號轉導、炎癥反應、缺氧反應、凋亡過程、衰老、記憶等有關（如圖5）。

其中有29個基因富集到生物學過程“炎癥反應”，有17個基因富集到生物學過程“凋亡過程”，分別有16個基因富集到生物學過程“衰老”和“應對缺氧”，此外有SLC6A4、HTR2A、PTGS2、DRD1、CNR1、CHRNA7等6個基因與“記憶”有關。因此，本文認為DSS在AD的治療作用可能是影響某些生物學過程，如衰老、凋亡、記憶、抗炎、應對缺氧等。

3.4.3 AD相關信號通路分析

通過網絡的建立，獲得了AD相關性基因與當歸芍藥散藥效成分之間關系的可視化圖，為確定當歸芍藥散中活性化合物與AD靶點的相互作用，首先對AD的197個潛在靶點進行了pathway富集分析，給出了使用OmicShare工具的KEGG路徑注釋的整體圖和富集的主要信號通路（見表4）；其次，根據KEGG路徑數據庫提供的阿爾茨海默病途徑建立“AD通路圖”。

表2 靶基因-器官定位數據

圖4 DSS有效成分預測的與AD相關基因靶器官定位圖

表3 GO功能富集數據

圖5 GOBP富集分析

3.4.3.1 pathway富集分析

本文將獲得的197個與AD相關性基因與人類整個基因組背景基因導入到OmicShare在線分析軟件中，獲得了目的基因相對于背景基因的富集統(tǒng)計圖（如圖6-A），本文針對于“信號轉導”模塊進行進一步分析獲得了“靶點-信號通路網絡圖”（如圖6-B）（圖中節(jié)點圓圈大小根據中心度進行設定）。結果顯示較多的靶點被富集到PI3K-Akt pathway（22個基因），cAMP sig?naling pathway（18個基因）和Calcium signaling pathway（16個基因）。

3.4.3.2 AD信號通路網絡

14個蛋白靶點被定位到AD信號通絡網絡中（如圖7），表明這些蛋白在AD中起著重要作用。AD發(fā)生與老年性斑塊沉積和神經纖維纏結有關。β淀粉樣蛋白（Aβ）是老年性斑塊的主要成分，對細胞和細胞器功能有多種病理影響。細胞內Aβ的沉積破壞線粒體功能，引起神經元凋亡從而導致認知功能障礙[17]。DSS一些成分的靶蛋白（APP，PSEN，ApoE）與Aβ聚集和tau過度磷酸化密切相關，可能是其神經保護功能的體現。GSK3β過度激活導致過度或異常tau磷酸化破壞細胞質功能，干擾軸突運輸，導致細胞死亡是AD的重要發(fā)病機制[18]。DSS 活性成分 DBP（M23）和 Myrican?one（M37）的藥物靶點為GSK3β可能通過抑制tau過度磷酸化達到治療AD的目的。此外，活性化合物betasitosterol（M19）靶向CASP3，CASP8和CASP9與凋亡通路密切相關，DSSactylenolideⅠ（M15），DSSactyleno?lideⅢ（M17）和Mandenol（M34）靶向TNF，DSSactyleno?lide Ⅰ（M15），Mairin（M33）和α-Amyrin（M50）靶向IL-1B與抗炎密切相關。因此，本文從AD信號通路圖的富集分析發(fā)現DSS可能主要通過減少Aβ的聚集和抑制tau過度磷酸化以及抗炎和抗凋亡等方面發(fā)揮治療AD的作用。

表4 信號通路富集數據

圖6 AD相關性基因pathway富集分析。

圖7 DSS預測靶點在AD-pathway信號通路中的富集圖

4 討論

近年來，中藥網絡藥理學已成為一個集中藥藥理學、生物化學、基因組學和生物信息學為一體的新的藥理學領域[19]。它提供了一個新的強大的工具來可視化分析草藥、化合物、靶點和疾病的復雜的交互數據[19]。近年來報道了一些關于網絡藥理學分析中藥治療AD的研究，如Cai等使用網絡藥理學方法揭示了補腎益智湯治療AD的潛在分子機制[20]。Qiang等對遠志散活性成分分析及靶點預測構建了“有效成分-AD靶標”網絡分析其治療AD的分子機制[21]。Luo等建立了多個草藥-化合物-靶點-信號通路互作網絡模型來分析DSS治療神經退行性疾病的作用機制[22]，其中報道了DSS主要通過抗炎，抗凋亡等途徑治療AD與本文結果一致。Fang等通過文獻挖掘PubMed報道的前十種抗AD草本植物，基于系統(tǒng)的藥理分析、從多個角度解釋這些草藥抗AD的作用機制[23]。這些研究基于多種藥草的聯(lián)合作用來探索中醫(yī)藥治療疾病復雜的作用機理，為研究中藥治療AD的機制提供了很多有價值的信息參考。本文基于網絡藥理學分析方法下對DSS活性成分進行篩選，靶點預測和疾病相關性分析，可視化構建了草藥-化合物-靶點網絡和草藥-化合物-靶點-AD網絡，本文共獲得了49種活性化合物的197個預測靶點與AD相關，網絡圖中自由度（degree）指與該節(jié)點相關聯(lián)的邊的條數，自由度高表明該化合物關聯(lián)的靶點越多，是當歸芍藥散的重要藥物成分[23]，我們發(fā)現DSS主要活性成分中oleic acid（M38，Degree=134）擁有最多的關聯(lián)靶點，其次是 DBP（M23，Degree=106）和EIC（M27，Degree=105），表明這些化合物可能比草藥-化合物-靶點網絡中的其他化合物具有更重要的藥理作用。同時，PTGS2（Degree=26）與化合物的關系最為密切，其次為GABBR1（Degree=20）和CHRM3（Degree=20）。H-C-T網絡分析結果表明當歸芍藥散的活性化合物具有多靶點效應。與AD密切相關的基因[24-26]，如APP，ACHE，BACE1，GSK3B，HTR2A，MAOB，TNF 等都出現在網絡中，體現了網絡藥理學預測的準確性。

老年性癡呆病位在腦，與五臟虛衰相關，其肝失疏泄，脾失健運，釀生痰濁血瘀而致癡呆。經方當歸芍藥散出自張仲景的《金匱要略》，其補血行氣活血，健脾益氣祛濕具有較好的治療效果[27]。其中“痰濁”的生化指標體現為代謝紊亂、氧化應激、凋亡和炎癥，本文通過DSS與AD相關性靶點的GO分析和pathway富集分析發(fā)現DSS治療AD的作用途徑主要與對藥物的反應、信號轉導、炎癥反應、缺氧反應、凋亡過程、衰老、記憶等有關，富集的信號通路主要有PI3K-Akt signaling path?way，以及與炎癥相關的TNF signaling pathway和NF-κB signaling pathway，與能量代謝相關的MAPK signal?ing pathway和AMPK signaling pathway等。這些結果從一定程度上對本文解釋中醫(yī)的施治理論給予了提示。

中醫(yī)理論認為人體是一個有機的整體，沒有一個器官是獨立存在的，它們在結構上不可分割，在功能上協(xié)調一致、相輔相成，在生物學功能上相互作用，本文對所有靶基因進行器官定位發(fā)現，靶基因定位最多的為肝，其次是心臟和腦，DSS以補肝養(yǎng)肝為要，雖然中醫(yī)學所說的“肝”，它不僅是指解剖學上的肝臟，更重要的是一個功能活動系統(tǒng)，是一較抽象的概念，如人的精神情志活動等都涉及中醫(yī)肝的功能范圍，但也涉及以肝與膽的功能失調和其經絡循行部位所引起的病癥為主，因此從一定程度上也能說明DSS治療AD與器官“肝”存在密切關系。其次，肝是以代謝功能為主的一個器官，是機體實現抗氧化，能量代謝，蛋白質合成等生物功能的重要場所，DSS防治AD的藥效靶點大量富集于肝說明其治療機制與調節(jié)機體代謝紊亂密切相關，也從另一方面驗證了最新的研究觀點--糖脂代謝紊亂在AD發(fā)病中起重要作用而把AD稱之為“3型糖尿病”[28,29]。本文結果提示中藥方劑DSS對AD的作用機制并非只針對于病灶“腦”，與心臟，肝，腎等多器官協(xié)調作用有密切聯(lián)系。

總之，本文通過系統(tǒng)藥理學方法對DSS進行了綜合分析，預測了DSS治療AD的潛在靶點，我們將在接下來的實驗中驗證這些預測靶點的可靠性，并進一步了解DSS治療AD的藥效作用機制，并為中醫(yī)藥防治復雜疾病提供一種可能的研究方案。此外，研究還需要進行體內活性化合物的測試，以進一步評估其應用于臨床的潛在可能性。