黃芪多糖鐵制備及表征

王 佳，李進霞，孫樹茂，谷 艷

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009）

缺鐵性貧血(IDA)是一種常見的疾病癥狀，是由于機體鐵離子缺乏引起的營養(yǎng)缺乏病。其高危人群為妊娠期、哺乳期的婦女、兒童等，輕度貧血即可影響兒童智力及生長發(fā)育[1]。小兒缺鐵性貧血主要由于先天儲鐵不足、后天攝鐵量不夠、鐵需要量增多、鐵吸收障礙及鐵丟失過多等，其根源是體內(nèi)鐵缺乏，故補鐵治療是缺鐵性貧血主要的治療手段[2]。目前臨床上主要使用硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵、富馬酸亞鐵等作為補鐵劑。這些亞鐵制劑雖然鐵含量高，吸收好，但副作用較大，易引發(fā)胃腸道刺激作用，造成便秘、腹瀉、腹上部疼痛等消化道副作用[3]，且亞鐵離子在體內(nèi)蓄積易促進內(nèi)源性自由基的生產(chǎn)，引發(fā)氧化毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化造成細胞膜損傷[4]。出于以上原因，亞鐵制劑作為補鐵劑治療缺鐵性貧血，效果并不理想，故近年來國內(nèi)外學(xué)者致力于研究非離子型高效低毒的新型補鐵劑。多糖鐵復(fù)合物作為補鐵劑具有合適的配位穩(wěn)定性，水溶性高，吸收率不低于亞鐵制劑，對胃腸道刺激作用較少，并且當(dāng)其釋放鐵之后，多糖亦可被吸收利用，發(fā)揮多糖的藥理作用[3]。

黃芪（Astragalus），屬豆科植物，是我國傳統(tǒng)中藥之一，主要產(chǎn)于山西、黑龍江、遼寧等地。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide）是黃芪主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、增強機體免疫力、防衰老等作用[5]。由于黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化性，黃芪多糖與鐵絡(luò)合形成的黃芪多糖鐵復(fù)合物可以緩減鐵離子攝入引發(fā)的胃腸道不良反應(yīng)以及體內(nèi)鐵蓄積引發(fā)的機體氧化損傷。因此，黃芪多糖鐵作為一種新型高效低毒的補鐵劑具有非常大的發(fā)展前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生儀器有限公司）；Tensor 27紅外光譜儀（德國Bruker公司）；恒溫水浴鍋（天津先權(quán)儀器有限公司）；冷凍干燥機（上海豫康儀器有限公司）。

黃芪購于山西，由大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院李進霞副教授鑒定。檸檬酸三鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵銨、鹽酸羥胺、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、亞鐵氰化鉀等購于天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.2 黃芪多糖的制備

參照文獻[6]:取黃芪藥材薄片100 g，按照1∶20料液比加入去離子水，在100℃水浴中回流提取3次，每次提取2 h，將提取液合并，并于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮。濃縮液加入終濃度為70%的無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬笾糜?℃冰箱中靜置過夜，3000 r/min離心10 min，取沉淀，用乙醇反復(fù)洗滌3次后按照Sevag法除蛋白，冷凍干燥得黃芪多糖（APS）。

1.3 黃芪多糖鐵復(fù)合物的制備

參照文獻[6]:取黃芪多糖1 g，檸檬酸三鈉0.5 g，加500 mL去離子水將二者充分混溶，緩慢逐滴加入2 mol/L三氯化鐵溶液并不斷攪拌，20%氫氧化鈉溶液滴入使反應(yīng)體系pH維持在9～10之間，當(dāng)出現(xiàn)紅棕色沉淀時，立即停止滴定，繼續(xù)振蕩6 h，3000 r/min離心15 min除去沉淀。上清液收集并加入終濃度為70%的無水乙醇，充分?jǐn)嚢瑁?000 r/min下離心10 min，取沉淀，用去離子水充分溶解，置于透析袋中除鹽，透析液濃縮后冷凍干燥，制得黃芪多糖鐵復(fù)合物（APS-Fe(III)）。

1.4 黃芪多糖鐵的鐵離子鑒別反應(yīng)

稱取黃芪多糖及黃芪多糖鐵各0.1 g，配制其水溶液（2 mg/mL）及鹽酸溶液（2 mg/mL）。于上述溶液中分批次滴加硫氰酸鉀，亞鐵氰化鉀，記錄溶液的顏色變化。

1.5 含鐵量測定

采用鄰菲啰啉分光光度法[6]:取樣品100 mg，加入1 mol/L鹽酸200 mL，充分溶解后靜置過夜，取上述溶液0.5 mL，依次加入10%鹽酸羥胺0.5 mL，10%鄰菲啰啉1.25 mL，pH 4.5的醋酸鹽緩沖液2.5 mL，充分混勻，靜置30 min，測其在510 nm下的吸光值。以硫酸亞鐵銨為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有測定均3次重復(fù)。

1.6 總多糖含量測定

采用硫酸苯酚分光光度法[7]:取樣品400 μL，加入5%苯酚400 μL，充分混勻，加濃硫酸2.0 mL，混勻并靜置，在490 nm處測其吸光值。以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有測定均3次重復(fù)。

1.7 紅外光譜

取待測樣品粉末，在烘干條件下KBr壓片，采用紅外光譜儀，測得4000 cm-1～400 cm-1波長范圍內(nèi)的吸收光譜[6]。

1.8 體外溶出度的測定

參照中國藥典2010年版附錄XC第二法(槳法)[8]:將黃芪多糖溶于0.1 mol/L鹽酸溶液中，設(shè)定轉(zhuǎn)速（100 r/min）與溫度（37±2℃），每隔30 min取樣3 mL于試管中，及時補充對應(yīng)劑量的溶劑。2 h后將溶液pH調(diào)至6.8，與上述相同條件下操作，在此體系下4 h內(nèi)取樣。將所取樣品溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，測定鐵溶出度[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵離子鑒別反應(yīng)

在黃芪多糖鐵水溶液中分別滴加硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀試劑，水溶液未出現(xiàn)顏色變化。而在黃芪多糖鐵鹽酸溶液中滴加硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀試劑后，前者出現(xiàn)血紅色絮狀絡(luò)合物（硫氰化鐵），后者出現(xiàn)深藍色沉淀（普魯士藍沉淀）。水溶液無顏色變化表明本實驗制備的黃芪多糖鐵中不含游離的鐵離子，黃芪多糖與鐵不是物理性混合，而是互相絡(luò)合。鹽酸溶液出現(xiàn)顏色變化表明強酸會使多糖與鐵之間的鍵斷開，使鐵離子游離并顯示出其特有的顏色反應(yīng)。

2.2 鐵含量及總多糖含量測定

本實驗采用黃芪多糖與鐵離子絡(luò)合制備黃芪多糖鐵復(fù)合物的制備方法[3]，多糖多羥基的結(jié)構(gòu)使其能與鐵絡(luò)合，這是多糖鐵復(fù)合得以制備的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。表1比較了黃芪多糖與黃芪多糖鐵的主要成分，結(jié)果顯示黃芪多糖本身含鐵量很低（0.23%），制備的黃芪多糖鐵復(fù)合物鐵含量較高，達到20.45%，經(jīng)計算，黃芪多糖與多糖鐵復(fù)合物的總多糖含量分別為20.72%和13.44%，表明鐵絡(luò)合后黃芪多糖鐵的總多糖含量有所降低。

表1 黃芪多糖及黃芪多糖鐵的鐵含量及總多糖含量

2.3 虎杖多糖紅外光譜

黃芪多糖及黃芪多糖鐵的紅外光譜如圖1所示，與黃芪多糖相比，黃芪多糖鐵也表現(xiàn)出多糖的典型吸收。黃芪多糖及黃芪多糖鐵在3340 cm-1處有較強吸收峰，為O-H的伸縮振動，2879 cm-1處的小肩峰為C-H的伸縮振動，1616 cm-1處的吸收峰為C=O伸縮振動，1377～1236 cm-1間2組吸收峰為C-H變角振動[9]。黃芪多糖鐵在651、582 cm-1處的吸收峰與FeOOH的特性吸收峰一致[6]，推測黃芪多糖鐵中有類似FeOOH的結(jié)構(gòu)。

圖1 黃芪多糖及黃芪多糖鐵的紅外光譜圖

2.4 多糖鐵體外溶出試驗

本實驗體外模擬與人體胃腸消化相似的pH體系，考察黃芪多糖鐵在該環(huán)境下的溶出度。圖2為黃芪多糖鐵在不同體系中的溶出度，黃芪多糖鐵加入模擬胃液30 min后，有50.34%的鐵離子溶出，60 min時86.45%的鐵離子溶出，120 min時鐵溶出度達到94.38%，鐵離子相對釋放完全。在模擬腸液的pH條件下，鐵離子緩慢穩(wěn)定溶出，4 h后，鐵離子溶出度可達97.77%，結(jié)果顯示，黃芪多糖鐵在體外模擬胃腸道條件下有較好溶出度，有利于鐵的吸收。

圖2 黃芪多糖鐵溶出度測定

3 結(jié)論

本研究以黃芪多糖及FeCl3為原料，在堿性條件下制備黃芪多糖鐵復(fù)合物，鐵離子鑒別實驗表明黃芪多糖與鐵互相絡(luò)合，且強酸條件下二者之間的鍵斷開，使鐵離子游離并顯示出其特有的顏色反應(yīng)。鄰菲啰啉分光光度法用于測定鐵含量，結(jié)果顯示制備的黃芪多糖鐵鐵含量較高，可達到20.45%，同時總多糖含量有所降低。通過紅外光譜測定可知黃芪多糖鐵也具有多糖的特征吸收，且與FeOOH有相近的吸收峰，推測黃芪多糖鐵中有類似FeOOH的結(jié)構(gòu)。在體外模擬人體胃腸消化環(huán)境實驗中，黃芪多糖鐵有較好溶出度，好的水溶性有利于鐵的吸收。黃芪多糖本身具有多種藥理活性，特別是顯著的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化性，上述2種性質(zhì)使得黃芪多糖與鐵絡(luò)合形成的黃芪多糖鐵可緩減鐵離子攝入過多引發(fā)的胃腸道刺激以及體內(nèi)蓄積引發(fā)的氧化毒性。因此，黃芪多糖鐵作為一種新型高效低毒的補鐵劑具有非常大的發(fā)展前景，有關(guān)黃芪多糖鐵的生理活性后續(xù)將做進一步研究。