丹參注射液對模型兔骨折圍手術(shù)期細胞因子TGF-β、TNF影響的實驗研究*

李 鵬 冉祥根 尉繼偉 趙志杰 劉軼韜

（山西大同大學附屬醫(yī)院，山西 大同 037005）

骨折愈合是外傷后骨組織、結(jié)構(gòu)、功能的恢復過程，其間伴隨著復雜而精細的生物學調(diào)節(jié)［1］。臨床中，骨折患者其骨折愈合速度、有無并發(fā)癥、傷肢有無血栓的形成等受到許多因素的影響，比如，細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能細胞因子，在骨折愈合過程中，對細胞增殖、分化以及細胞外基質(zhì)合成起重要調(diào)節(jié)作用［2-3］；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種多效性細胞因子，對骨折的預后也有一定的影響。因此，我們建立了兔四肢骨折的模型，進行圍手術(shù)期檢測模型兔血清中TGF-β、TNF-α的濃度變化，觀察上述因子與骨折愈合的相關(guān)性，觀察使用抗凝藥物、活血化瘀類中藥對于骨折術(shù)后愈合的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只健康雄性大白兔，體質(zhì)量（5±0.5）kg，清潔級，批號：11804800013889，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供。按照國際實驗動物科學理事會的指導方針進行，并獲得大同大學動物實驗倫理委員會的批準。

1.2 藥物與試劑 低分子肝素鈣，批號：20151122，規(guī)格：每支5000 IU，海南通用同盟藥業(yè)有限公司提供。丹參注射液，批號17060224，規(guī)格10 mL×1支，生產(chǎn)廠家：成都天臺山制藥有限公司。檢測試劑由北京北方生物技術(shù)研究所提供，使用科大創(chuàng)新股份有限公司GC-911γ放射免疫計數(shù)儀。內(nèi)固定材料（掌骨鋼板、螺絲釘），批號：1602920。規(guī)格：ZSZ07 5孔。江蘇金鹿醫(yī)療器械有限公司提供。

1.3 造模與分組 自創(chuàng)試驗動物模型。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg自耳緣靜脈注入，麻醉顯效后，將試驗大白兔股骨干包紗布墊懸空固定于兩款金屬塊之間，使用金屬榔頭敲擊動物股骨干造成股骨干骨折，骨折類型為閉合性骨折，X線拍片明確骨折，隨后對閉合性骨折模型的傷肢體進行簡單外固定，避免加重損傷，模型制作成功待用。按隨機數(shù)字表法分為低分子肝素鈣組15只，丹參注射液組15只，模型對照組10只。傷后72 h內(nèi)行內(nèi)固定術(shù)。術(shù)前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg自耳緣靜脈注入，麻醉顯效后，對傷肢體毛發(fā)進行剪切、脫毛劑處理；手術(shù)野皮膚消毒，逐層切開組織，顯露骨折端，清除血腫，應用掌骨鋼板行股骨干骨折切開復位內(nèi)固定術(shù)；縫合傷口并包扎；術(shù)后X拍片復查骨折固定穩(wěn)定。動物蘇醒2～3 h后可自由進食。

1.4 給藥方法 內(nèi)固定手術(shù)后0.5 h，開始對低分子肝素鈣組皮下注射低分子肝素鈣，每次注射量為100 IU，每日1次，連用7 d。丹參注射液組術(shù)后0.5 h開始應用丹參注射液，1 mL肌肉注射，每日1次，連用7 d。模型對照組平行注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.5 標本采集與檢測 分別于術(shù)前1 d、術(shù)后24 h、術(shù)后72 h、術(shù)后7 d空腹狀態(tài)下取外周靜脈血，測定TGF-β、TNF-α。采用放射免疫法，測定方法均嚴格按照藥盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況 術(shù)后7 d各組實驗動物均未出現(xiàn)傷肢腫脹和運動障礙。正常飲食，無動物死亡。

2.2 各組手術(shù)前后TGF-β水平比較 見表1。低分子肝素鈣組術(shù)后TGF-β水平開始升高，術(shù)后1 d顯著升高，高于模型對照組（P<0.01），術(shù)后7 d回落至最低，但較術(shù)前仍略有升高。丹參注射液組TGF-β水平變化趨勢與低分子肝素鈣組相同，但術(shù)后24、72 h較低分子肝素鈣組升高更明顯（P<0.01）。模型對照組TGF-β水平變化規(guī)律同其他兩組，幅度明顯為低。

表1 各組手術(shù)前后TGF-β 水平比較（ng/L，x±s）

2.3 各組手術(shù)前后TNF-α水平比較 見表2。低分子肝素鈣組術(shù)后1 d TNF-α水平顯著升高（P<0.01），術(shù)后3 d下降明顯，術(shù)后7 d接近術(shù)前水平（較術(shù)前仍略高）。丹參注射液組TNF-α水平變化與低分子肝素鈣組相同，但較低分子肝素鈣組更明顯（P<0.01），術(shù)后7d接近術(shù)前水平。模型對照組變化規(guī)律同實驗組，幅度明顯為低，術(shù)后7 d仍高。

表2 各組手術(shù)前后TNF-α 水平比較（ng/L，x±s）

3 討 論

髖部及下肢骨折時深靜脈血栓一直是重要并發(fā)癥，嚴重影響生存和術(shù)后恢復；同時營養(yǎng)血管易受傷，導致骨折段供血不足，發(fā)生遲緩愈合或不愈合。用什么方法處理既能預防深靜脈血栓形成又能促進骨折愈合，這是臨床治療中很有意義的一個課題。

3.1 關(guān)于深靜脈血栓的處理 低分子肝素鈣作為臨床常用的抗凝藥物多年來一直用于術(shù)后抗凝治療，結(jié)合有效的預防措施，明顯降低深靜脈血栓并發(fā)肺栓塞的病死率，早期進行預防性治療甚為重要。低分子肝素鈣能刺激內(nèi)皮細胞釋放組織因子凝血途徑抑制物和纖溶酶原活化物，不被第4因子中和，對血小板功能亦無明顯影響；對血栓溶解有間接協(xié)同作用，可用于治療已形成的深部靜脈血栓［4］。在發(fā)揮抗栓作用時，出血的可能性較小。

在預防靜脈血栓方面中醫(yī)學有明顯的優(yōu)勢，丹參是我國傳統(tǒng)中藥中的代表藥，有良好的活血化瘀功效。以丹參注射液為干預因素預防深靜脈血栓形成的作用，有效且安全地降低了血黏度，同時血清超氧化物歧化酶（SOD）活性升高、丙二醛（MDA）含量降低，提示丹參能減輕脂質(zhì)過氧化反應及提高機體抗氧化能力，并減輕血管內(nèi)皮細胞受損，因而可以推測，丹參可能正是通過提高機體抗氧化能力減輕脂質(zhì)過氧化反應，達到保護血管內(nèi)皮細胞的作用，從而起到預防深靜脈血栓形成的作用［5］。

丹參多酚酸鹽主要成分為丹參乙酸二鉀、丹酚酸B鎂等，不但具有活血化瘀功效，還對血小板聚集和纖維蛋白原具有抑制作用。另有研究證實，丹參多酚酸鹽與低分子肝素鈣比較，前者在改善下肢骨折術(shù)后肢體腫脹程度、沉重感、肢圍差等方面更具優(yōu)勢。下肢骨折術(shù)后聯(lián)合應用低分子肝素鈣和丹參多酚酸鹽，能夠有效預防下肢深靜脈血栓形成，值得臨床推廣應用［6］。丹參注射液預防治療下肢深靜脈血栓形成療效顯著，預防用藥療效明顯優(yōu)于治療用藥，而穴位用丹參注射液通過體表穴位吸收和經(jīng)絡(luò)傳導，藥效具有放大作用，這種放大作用可能是由于經(jīng)絡(luò)區(qū)域的導向性，能直接把藥物送到相關(guān)組織中而提高了療效［7］。

3.2 關(guān)于對細胞因子影響及骨折的愈合 TGF-β是一組廣泛存在、功能相似、結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長因子和有效的趨化因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種不同結(jié)構(gòu)的TGF-β，在骨組織和血小板中有大量的TGF-β存在。骨折愈合中TGF-β的調(diào)控通路和作用機制進一步被認知，對促進骨折愈合有積極的意義。老年骨折為臨床常見的骨折，多因骨質(zhì)疏松導致髖部骨小梁結(jié)構(gòu)改變，導致其TGF-β分泌能力的降低［8］。術(shù)后應用低分子肝素鈣、丹參注射液可以預防深靜脈血栓的發(fā)生率，但這些藥物的使用是否可造成骨折不愈合或延遲愈合？本實驗研究中發(fā)現(xiàn)：丹參注射液、低分子肝素鈣抗凝治療不僅可以預防深靜脈血栓形成，對于圍手術(shù)期術(shù)后細胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的濃度升高具有一定的促進作用，應用丹參注射液組較應用低分子肝素鈣組升高明顯；同時實驗動物均沒有出現(xiàn)傷肢腫脹和運動障礙表現(xiàn)。研究認為［9］，丹參及其有效成分可以優(yōu)化骨代謝過程，在女性骨質(zhì)疏松以及骨折后愈合等方面均有積極作用。中醫(yī)學認為丹參具有活血化瘀、清熱解毒、涼血消腫的功效，較多國內(nèi)外研究在對丹參的有效成分進行深入研究后發(fā)現(xiàn)，丹參可影響骨折愈合過程中的關(guān)鍵因子而發(fā)揮作用，在骨折早期及中期治療中有促進骨折愈合的作用［10-11］。

丹酚酸B能促進新生大鼠成骨細胞增殖，成骨細胞上清液中骨鈣素含量增加，且能促進成骨細胞生成礦化結(jié)節(jié)，說明丹酚酸B具有促進成骨細胞基質(zhì)礦化的作用［12］。張曉等發(fā)現(xiàn)丹參注射液能促進人成骨細胞生成骨鈣素，并使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，說明丹參能促進人成骨細胞成熟并提高其活性［13］。丹參注射液能促進骨折愈合過程中BMP-7、TGF-β及FGF生長因子的表達，且成骨細胞和破骨細胞數(shù)量均增多［14］。

TNF-α在誘導炎性細胞聚集、介導細胞死亡、增殖、遷移等方面有重要作用［15-16］；當機體受到創(chuàng)傷后，TNF-α是機體應激反應產(chǎn)生最早的、最核心的炎癥介質(zhì)，它在創(chuàng)傷后24 h達高峰，72 h可降至正常［17］。TNF-α對骨折修復過程具有雙相調(diào)節(jié)作用。既往研究表明，TNF-α抑制新骨生成、刺激骨吸收。近年來隨著對TNF-α的結(jié)構(gòu)及作用機制的進一步研究，它在參與骨折修復方面的作用有了新的認識，TNF-α不僅可以促進破骨細胞的分化而且具有誘導成骨細胞形成促進成骨作用［18］。肝素應用于臨床已有多年歷史，目前許多研究證實肝素對TNF-α水平有抑制。丹參能顯著抑制白細胞聚集，也可降低血清TNF-α［19］。我們在實驗研究中發(fā)現(xiàn)在應用丹參注射液、低分子肝素鈣抗凝治療后，TNF-α的濃度升高受到明顯的抑制作用，這與上述文獻資料相近。

使用TGF-β治療骨折是一前瞻性的研究，但必須解決TGF-β的毒性、免疫原性、所使用的劑型、劑量等因素。對于骨折是單用一種TGF-β還是聯(lián)合應用其他生長因子如胰島素樣生長因子（IGF-I）等，同時如何抑制TNF-α升高，這些基礎(chǔ)研究和臨床應用研究的有機結(jié)合，中西醫(yī)聯(lián)合治療的介入，相信TGF-β、IGF-I、TNF-α等細胞因子將會成為治療難愈骨折和骨病的重要方法之一。