四逆湯對(duì)高脂血癥合并動(dòng)脈粥樣硬化兔模型血清炎性因子的影響*

王元紅 郁保生 雎世聰 鄒旭峰 龍 飄

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）主要累及動(dòng)脈血管內(nèi)壁，使其增厚變硬，管腔縮小，失去彈性，繼而內(nèi)膜出現(xiàn)脂質(zhì)或糖類、蛋白質(zhì)堆積，在外界刺激下發(fā)生血管破裂或血栓形成，嚴(yán)重危害人類健康［1］。隨著我國生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)改變，AS是眾多疾病 （諸如腦梗死、心肌梗死、脂肪肝、肝硬化、慢性腎病等）的形成、病發(fā)乃至惡化的重要原因之一。其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，并且呈年輕化發(fā)展［2］。因此，AS的臨床特征、病理機(jī)制及中、西藥研發(fā)已成為近年來研究熱點(diǎn)。高脂血癥（HLP）主要是機(jī)體脂肪代謝障礙而導(dǎo)致血清總膽固醇（TC）或三酰甘油（TAG）水平過高的一種病癥。HLP能夠誘發(fā)并促進(jìn)AS的形成，是 AS的病理因素之一，兩者關(guān)聯(lián)密切［3］。藥理研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，四逆湯及其各成分提取液均對(duì)超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力，可通過抑制巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，從而達(dá)到降脂的目的。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［6］，四逆湯可明顯減緩AS程度，減輕內(nèi)膜增厚水平，減少內(nèi)膜的脂質(zhì)斑塊面積，并減少凋亡泡沫細(xì)胞數(shù)量，繼而減少炎性因子的釋放，控制非特異性免疫反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，筆者以四逆湯抗炎作用為切入點(diǎn)，觀察四逆湯對(duì)HLP合并AS兔模型血清相關(guān)炎性因子的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭雄性純種大耳白兔60只，3月齡，體質(zhì)量（2±0.5） kg，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0005，湖南東創(chuàng)科技實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫（20±2） ℃、相對(duì)濕度（60±5）%的環(huán)境，采用12 h/12 h明暗光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 四逆湯由附子、干姜和炙甘草組成，購于湖南楚仁堂醫(yī)藥連鎖有限責(zé)任公司，批號(hào)：410075782，藥物劑量按 2∶3∶4（附子 15 g，干姜 23 g，炙甘草31 g）在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科制備成四逆湯浸膏（每1 g浸膏含生藥4.8 g）。阿托伐他汀鈣片，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號(hào)H19990258，批號(hào)：090203440。雙重蒸餾水由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器 膽固醇（河南利偉生物藥業(yè)股份有限公司）；丙硫氧嘧啶（50 mg/片，上海朝暉藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021082）；蛋黃粉（鄭州中成化工有限公司）；豬油（市售）；20%烏拉坦（上?；瘜W(xué)試劑公司，生產(chǎn)批號(hào)：20150123）；TC、TG檢測(cè)試劑盒 （上海晶都生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：JD1726、JD1721）；兔白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等 ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，CSB-E06903Rb）。JY3002型電子天平（瑞士METTER，AE100）；TGL16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （德國Eppendorf公司）、SB3200型超聲波清洗機(jī)（必能信超聲上海公司）、全自動(dòng)生化分析儀 Roche Hitachi917型 （日本 Olympus公司）、BCD-226STC型冰箱（美國Thereto公司）、RM23235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司）。

1.4 分組與造模 將實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、阿托伐他汀組、四逆湯低劑量、四逆湯中劑量組、四逆湯高劑量組，每組10只。正常組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高膽固醇飼料 ［膽固醇1%，豬油5%，蛋黃粉10%，基礎(chǔ)飼料84%，將豬油加熱至液體狀，與膽固醇、蛋黃粉拌勻，每100 g高膽固醇飼料中加入20 mg丙硫氧嘧啶（10 mg/kg），一起加入普通飼料拌勻加工成丸劑］［7］造模。日食量按120～150 g分籠給予，飲水不限，連續(xù)喂養(yǎng)12周。每周定期稱體質(zhì)量1次并記錄。成模標(biāo)準(zhǔn)：酶檢測(cè)兔血清血脂水平提高，其次通過病理切片觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊情況。

1.5 給藥方法 造模成功后，各給藥組家兔按被試因素施加方法，連續(xù)4周給予藥物治療。西藥組按1 g/（kg·d）給予阿托伐他汀鈣片，磨碎拌入高脂飼料；四逆湯低、中、 高劑量組家兔將浸膏按 3.03、6.06、12.12 g/（kg·d）（按成人等效劑量折算［8］），拌入高脂飼料；模型組繼予高脂飼料；正常組繼予普通飼料，于早晨9∶00一次性飼喂。各組干預(yù)時(shí)間均為4周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的檢測(cè)。干預(yù)4周后，兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉固定，迅速剖開腹腔，取腹主動(dòng)脈血2 mL，分別注入10%EDTA-Na 230 μL 試管、4 萬 U/mL 抑肽酶 40 μL試管，混勻，離心，取上清液，存于-20℃冰箱中。取冰凍血清標(biāo)本，常溫融化，預(yù)估濃度。于空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔分別加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品100 μL，不觸及孔壁。封板后置37℃溫育60 min。每孔加入100 μL工作液A，封板，孵育 35 min，洗板3次，甩干。每孔加入100 μL工作液B，封板，孵育60 min，洗板5次，甩干。每孔注入顯色劑90 μL，37℃避光顯色。每孔依序加50 μL終止液，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)各孔光密度值（OD值）。2）動(dòng)脈病理組織觀察。提取腹主動(dòng)脈，游離上端至主動(dòng)脈，剪取小段置于凍存管，液態(tài)氮保存，另取小段4%PF液固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm）、烤片、脫蠟、HE染色、封片，鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較方差齊者LSD法，方差不齊時(shí)Tamhane′s T2法。不滿足正態(tài)性分布選擇秩和檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型鑒定 見圖1，表1。HE染色示：正常組兔主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)清晰可見；模型組管壁內(nèi)可見大量斑塊和脂質(zhì)沉積，表明在造模后家兔主動(dòng)脈管壁各層組織受到一定的損傷。造模第12周，經(jīng)抽樣檢測(cè)，與正常組比較，模型組兔血清TC、TAG水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明造模成功。

圖1 正常組、模型組家兔主動(dòng)脈管壁組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，400 倍）

表1 兩組家兔血清TC、TAG水平比較（mmol/L，x±s）

2.2 各組家兔主動(dòng)脈病理觀察結(jié)果 正常組兔主動(dòng)脈壁各層次清楚，管腔內(nèi)壁光滑、無脂質(zhì)浸及，平滑肌細(xì)胞整齊排列，無斑點(diǎn)。與模型組比較，四逆湯高劑量組抑制泡沫細(xì)胞形成和平滑肌細(xì)胞的增生與重構(gòu)效果顯著；四逆湯中劑量組血管炎癥浸潤(rùn)程度降低，脂質(zhì)斑塊排列整齊；阿托伐他汀組脂質(zhì)斑塊較少，但主動(dòng)脈內(nèi)膜仍有大量泡沫細(xì)胞聚集；四逆湯低劑量組抗炎、降脂效果均不明顯。見圖2。

圖2 各組家兔主動(dòng)脈組織形態(tài)觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組家兔血清 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量比較 見表2。與正常組比較，模型組IL-6、TNF-α、IFN-γ 含量顯著升高（P<0.01），IL-10 顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，四逆湯高、中劑量組及阿托伐他汀組家兔 IL-6、TNF-α、IFN-γ 顯著降低 （P<0.05 或P<0.01），IL-10 顯著升高（P<0.01），四逆湯低劑量組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量與模型組比較， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表 2 兩組兔血清 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 含量比較（ng/L，x±s）

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化可歸入中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”“痰飲”等范疇。病機(jī)為心、脾、腎臟功能虛衰，以致痰濁、瘀血、水濕等病理產(chǎn)物停滯于脈中，阻塞脈道，全身氣血運(yùn)行失常，屬本虛標(biāo)實(shí)之病［9］。 如《石室秘錄·痰病》認(rèn)為“肥人多痰，乃氣虛也。然補(bǔ)氣又不可純補(bǔ)脾胃之土，當(dāng)兼補(bǔ)其命門之火”［10］，說明補(bǔ)足陽氣有助祛除痰瘀之邪，為治療脂質(zhì)代謝類疾病開拓新思路?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》［11］指出“陽化氣，陰成形”，若“陽化氣”功能減弱，易氣、血、津液運(yùn)行不暢而變生瘀血、痰飲、水濕等病理產(chǎn)物，以致痰瘀互阻，動(dòng)脈斑塊形成。 《醫(yī)理真?zhèn)鳌罚?2］謂四逆湯是“回陽之主方也”，君以附子溫腎暖陽，補(bǔ)先天欲絕之火種；臣以干姜入脾胃、心經(jīng)，達(dá)溫中逐寒、回陽通脈之功，繼以甘草，緩其正氣，制其毒性。該方配伍藥精力專，心脾腎臟之本得以兼顧，則內(nèi)生病理產(chǎn)物得以祛除。

動(dòng)脈硬化是血管壁內(nèi)膜發(fā)生纖維組織增生，粥樣病變是在動(dòng)脈內(nèi)膜處形成斑塊，斑塊的主要成分是平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、膠原纖維和蛋白多糖［13］。關(guān)于AS的發(fā)病機(jī)制，先后有脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等，但目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為AS是在多種因素作用下，發(fā)生病理改變而產(chǎn)生的［14］。

細(xì)胞因子是一種低分子量可溶性蛋白質(zhì)，通過自分泌或旁分泌的方式作用于自身或其他細(xì)胞，分為促炎因子和抗炎因子。前者包括IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及近年來新發(fā)現(xiàn)的IL-23、IL-17等，主要表現(xiàn)為促炎作用；后者包括IL-4、IL-10、TGF-β等，主要表現(xiàn)為抗炎作用。其中，IL-6、TNF-α是機(jī)體產(chǎn)生的一類重要促炎因子，生物活性廣泛，在介導(dǎo)炎性反應(yīng)及參與組織損傷與修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用［15］。IL-6作為早期炎性反應(yīng)的敏感指標(biāo)之一，可促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)其吞噬殺傷作用［16］。TNF-α能夠增強(qiáng)AM的表達(dá)、誘導(dǎo)血小板的聚集，介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)病變進(jìn)展和斑塊形成［17］。TNF-α作為AS炎性反應(yīng)的標(biāo)記物，能有效體現(xiàn)炎癥活躍程度。IFN-γ是一種重要的免疫活化因子，主要由 Th1細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，可以促進(jìn)固有細(xì)胞的免疫活化，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞。IFN-γ通過對(duì)相關(guān)炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)，而誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，引起內(nèi)皮損傷及功能降低，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成［18］。IL-10 由 CD4+淋巴細(xì)胞亞群（Th2）和巨細(xì)胞產(chǎn)生，它通過抑制IL-6、TNF-α的分泌，而減少炎性細(xì)胞因子的釋放以達(dá)到抗炎作用［19］。炎癥反應(yīng)與以上各類因子的異常表達(dá)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高脂及免疫損失誘導(dǎo)下，模型組 IL-6、TNF-α、IFN-γ 表達(dá)頗高，IL-10 表達(dá)頗低，四逆湯能降低HLP合并AS模型兔 IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)，升高IL-10的表達(dá)。從四逆湯對(duì)兔血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10的影響可以看出，四逆湯高劑量組效果最顯著，其次為四逆湯中劑量組和阿托伐他汀組，效果最低的是四逆湯低劑量組，表明四逆湯對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)具有劑量依賴性。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IL-6與IL-10呈負(fù)相關(guān)，說明IL-6表達(dá)水平越高，IL-10表達(dá)水平越低，二者之間相互影響。筆者分析AS病變發(fā)生機(jī)制之一可能是IL-6與IL-10之間比例失衡導(dǎo)致的，提示四逆湯可能通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子間的平衡而減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。四逆湯抗炎作用的具體機(jī)制今后將進(jìn)一步從炎癥反應(yīng)甚至蛋白表達(dá)方面研究。