活血化痰方對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響*

李益萍 張言玉 許笑雯 王肖龍

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 上海 201203）

目前，我國心血管患者約有 2．9 億［1］。 脂代謝紊亂在心血管病的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，有效控制血脂可降低心血管事件的發(fā)生風險［2-3］。他汀類藥物已成為動脈粥樣硬化性疾病治療基石。但在臨床實踐中，許多患者單用他汀類藥物治療其血脂水平仍不能達標。2012年血脂異常國際研究——中國住院患者他汀類藥物治療率88．9%，接受治療患者中，38．5%未達低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）目標值［1］。 他汀作用靶點單一，主要是抑制細胞內(nèi)膽固醇的合成，他汀劑量加倍僅能使LDL-C再降低6%左右，而肝臟損害及橫紋肌溶解等不良反應(yīng)的發(fā)生率增加。血脂的調(diào)節(jié)是一個復雜的過程，涉及多種途徑、多種基因的調(diào)控，不同的降血脂途徑間又有一定的關(guān)聯(lián)性，不能靠單一的途徑或靶點來解決。因此，在他汀類藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合其他降膽固醇機制的藥物可能具有協(xié)同降低 LDL-C的優(yōu)勢，成為近年臨床關(guān)注的熱點。鑒于目前現(xiàn)代醫(yī)學中其他降膽固醇機制的藥物因其價格昂貴或缺乏臨床硬終點的證據(jù)，短期內(nèi)無法大量廣泛應(yīng)用于臨床。基礎(chǔ)和臨床研究表明中藥可以影響膽固醇吸收、體內(nèi)合成、轉(zhuǎn)運、排泄等代謝途徑，改善臨床心血管事件終點［4］。因此觀察中醫(yī)藥對膽固醇其他代謝途徑的作用并深入探討其機制，能夠為發(fā)展中醫(yī)藥和臨床干預提供確切的依據(jù)?；钛捣绞潜狙芯拷M在“痰瘀同治”的治法下，沿用并繼承經(jīng)典原方《太平惠民和劑局方》二陳湯、四物湯合《濟生方》二至丸自擬的降脂方，主要由丹參、當歸、陳皮、決明子、山楂、黃連等組成。研究發(fā)現(xiàn)活血化痰方中黃連、決明子、山楂等組成成分可通過調(diào)控膽固醇的代謝途徑中的重要酶活性、蛋白或基因的表達來降脂［4］。因此，本研究旨在觀察活血化痰方的降脂效果及探索其降脂的分子機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取36只SPF級別SD雄性大鼠，180～200 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（動物許可證號：SCXK2017-0005），所有大鼠分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境干燥、通風，溫度20～26℃，濕度40%～70%。高脂飼料配方：78.8%繁殖鼠料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽。由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供，生產(chǎn)許可證號：蘇飼證（2014）01008。

1.2 試劑與儀器 活血化痰方水煎液：委托上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑科采購中藥并制備水煎液?？啥ǎ郯⑺估邓帢I(yè)（中國）有限公司，批號：132756］。試劑：總膽固醇（TC）測定試劑盒、三酰甘油（TAG）測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒、血清前蛋白枯草酶溶菌素9（PCSK9）酶聯(lián)免疫試劑盒、血漿卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）酶聯(lián)免疫試劑盒、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP）酶聯(lián)免疫試劑盒和肝脂酶（HL）酶聯(lián)免疫試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。儀器：Beckman coulter離心機 （美國貝克曼）；高速冷凍離心機（Neofuge13R，Heal Force）；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標儀 （芬蘭制造）；Mettler-Toledc電子天平 （上海梅特勒-托儀多公司）；動物手術(shù)器械（上海玉研科學儀器有限公司）；10%甲醛（上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號：RS-40371）；石蠟切片機（上海榕柏生物技術(shù)有限公司）；光學顯微鏡（上海思長約光學儀器有限公司）；渦旋振蕩器 votex-2（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；15 mL硅化離心管（corning）；10 mL無菌注射器 （上?？等R德企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司）。

1.3 實驗方法 SD大鼠36只據(jù)體質(zhì)量和隨機數(shù)字表完全隨機區(qū)組分組，共分為6組（n=6）：空白組、模型組、可定組、活血化痰方低劑量組、活血化痰方等效劑量組、活血化痰方+可定組?？瞻捉M予基礎(chǔ)飼料，其余各組均予高脂飼料（10 g飼料/100 g）。造模的同時各藥物組按人-動物藥物劑量換算表分別給予相應(yīng)藥物灌胃，灌胃劑量：可定組（0.76 mg/kg）、活血化痰方低劑量組（3.5 g/kg）、活血化痰方等效劑量組（14 g/kg）、活血化痰方+可定組（活血化痰方14 g/kg，可定0.76 mg/kg），空白組和模型組分別給予等量蒸餾水灌胃。各組動物均自由飲水攝食，每周稱體質(zhì)量1次，以調(diào)整飼料喂養(yǎng)量及藥物灌胃量。實驗周期為8周。

1.4 標本采集與檢測 喂養(yǎng)8周后，各組動物禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量后行3%戊巴比妥稱定質(zhì)量麻醉，剪開皮膚肌肉，找到腹主動脈，3.8%枸櫞酸鈉潤洗的10 mL注射器，以腹主動分叉處向心端1～3 mm處穿刺取血，取血后3000 r/min，離心10 min后分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。處死動物后迅速分離肝臟，在4℃0.9%氯化鈉注射液中漂清血水，使用濾紙吸干后浸泡于10%福爾馬林備用。采用生化法檢測大鼠血清 TAG、TC、HDL-C、LDL-C 的水平；采用 ELISA 法測定PCSK9、LCAT、CETP、HL的水平，以上指標均嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。肝臟病理：將浸泡于10%甲醛中的肝臟經(jīng)石蠟包埋切片，常規(guī)取材和固定、脫水和包埋、切片及染色等操作后，置于光學顯微鏡下，以觀察各組大鼠肝臟。

1.5 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPASS18.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（x±s）表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］表示。 符合正態(tài)性及方差齊性組間比較使用單因素方差分析，不符合正態(tài)性和 （或）方差齊性組間比較使用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示存在統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 見表1。各組間治療前大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；8周后，各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，x±s）

2.2 各組大鼠血脂水平比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清的 TC、TAG、LDL-C 顯著上升（P<0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清的TAG、LDL-C均下降（P<0.05）；與模型組比較，可定組與活血化痰方+可定組的TC顯著下降（P<0.05）。

表2 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

2.3 各組大鼠血脂代謝途徑的影響比較 見表3。與模型組相比，活血化痰方低劑量組、活血化痰方等效劑量組、活血化痰方＋可定組的PCSK9均下降（P<0.05），活血化痰方等效劑量組的HL有升高的趨勢。

2.4 各組大鼠肝臟組織病理結(jié)果 見圖1。肉眼觀察空白組大鼠肝臟外形正常，包膜光滑，顏色暗紅；模型組大鼠肝臟體積明顯增大，顏色淡黃，包膜緊張，質(zhì)地較軟，切面有油膩感。光鏡下觀察，空白組大鼠肝小葉和肝細胞索結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)較多大小不等的脂肪滴，部分肝細胞核被脂肪滴擠壓而明顯偏位，脂質(zhì)沉積明顯，肝臟脂肪變性程度較為嚴重；與模型組比較，各藥物組肝小葉和肝細胞索結(jié)構(gòu)較為清晰，且肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性程度明顯減輕；可定組肝臟細胞出現(xiàn)明顯的細胞腫脹現(xiàn)象。

表3 各組大鼠血脂代謝途徑比較（ng/mL，x±s）

圖1 各組肝臟組織結(jié)構(gòu)（HE染色，20倍）

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學在他汀類藥物基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用不同作用機制的降脂藥物主要有依折麥布［5］、PCSK9抑制劑、微粒體TAG轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑等，但因其價格昂貴［6］或缺乏臨床硬終點的證據(jù)［7-8］，短期內(nèi)無法大量廣泛應(yīng)用于臨床。中醫(yī)藥也進行了許多的基礎(chǔ)與臨床干預研究，如中國冠心病二級預防研究發(fā)現(xiàn)采用血脂康常規(guī)劑量適度調(diào)脂，就可使中國冠心病患者獲益［9］。高脂血癥的形成與肝脾腎的功能失調(diào)密切相關(guān)，肝脾腎功能失調(diào)為本、痰瘀阻滯為標，本虛標實相互作用形成惡性循環(huán)，日久脈絡(luò)受損，引發(fā)心腦血管病。臨床上高脂血癥患者往往痰濁與血瘀并見［10-11］，故本研究組在“痰瘀同治”的治則下，自擬了“活血化痰方”。

本實驗研究結(jié)果表明活血化痰方低劑量與等效劑量組均可有效降低高脂血癥SD大鼠血清TAG和LDL-C的水平，其療效與可定一致，活血化痰方與可定聯(lián)合應(yīng)用有進一步降低LDL-C水平的趨勢。PCSK9是參與膽固醇轉(zhuǎn)運過程的一種重要蛋白酶，可在蛋白水平降低肝細胞表面LDLR的數(shù)量，從而降低肝細胞對血液中LDL-C的清除能力，因此抑制PCSK9的活性及表達可降低體內(nèi)LDL-C的水平。當血液中LDLC水平增加時，肝細胞內(nèi)LDL-C水平降低，肝細胞表面LDLR的數(shù)量減少，從而血清PCSK9的水平會反饋性減少，這與本研究結(jié)果一致。他汀在降脂的同時可引起的PCSK9分泌增加，此種效應(yīng)會降低（至少部分）他汀的療效［12-14］。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，與單純可定組相比，活血化痰方＋可定組具有進一步降低LDL-C、PCSK9水平的趨勢，這提示活血化痰方可抑制他汀類藥物引起的PCSK9反饋性增加，具有潛在增加他汀類藥物降脂療效的作用。

HL是參與脂蛋白代謝過程的關(guān)鍵酶之一，HL活性增強可降低TAG水平［15］。本研究發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，可定組的HL水平明顯降低，中藥等效劑量組的HL有升高趨勢，而基礎(chǔ)研究顯示活血化痰方可降低TAG，說明活血化痰方降低TAG的機制可能與升高血清HL水平有關(guān)。LCAT、CETP為參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運過程的2種重要蛋白，兩者活性及表達的增強可促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運，降低血液和動脈粥樣硬化斑塊中的膽固醇［16］。動物實驗結(jié)果表明，活血化痰方未顯示出對LCAT、CETP水平有影響，這與HDL-C的統(tǒng)計分析結(jié)果一致。

肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要場所，各種原因引起脂質(zhì)代謝紊亂均可導致肝細胞脂質(zhì)沉積和肝臟脂肪變性。動物實驗肝臟病理結(jié)果表明活血化痰方可能通過抑制肝臟合成和（或）促進肝臟排泄等途徑影響脂質(zhì)在肝細胞的沉積，是否與調(diào)控膽固醇細胞內(nèi)合成相關(guān)的HMGCoA還原酶，與膽固醇肝臟排泄相關(guān)的膽固醇-7α 羥化酶（CYP7A1）［17］等的表達有關(guān)，尚需進一步通過實驗驗證。

綜上，本研究認為活血化痰方能有效降低高脂血癥大鼠血清LDL-C、TAG水平，與可定的降脂療效相當，其機制可能分別與其調(diào)節(jié)血清PCSK9水平、升高血清HL水平有關(guān)，同時活血化痰方能夠顯著改善高脂血癥大鼠肝臟的脂質(zhì)沉積。但活血化痰方調(diào)節(jié)血脂的確切機制尚需進一步的研究，以明確其更有效的作用靶點。