超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法研究噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的殘留動態(tài)及安全性評估

張 栩，王偉民，董茂鋒，溫廣月，劉福光

(上海市農業(yè)科學院農藥安全評價研究中心，上海 201106)

噻蟲嗪是一種全新結構的第二代煙堿類高效低毒殺蟲劑，對害蟲具有胃毒、觸殺及內吸活性，可有效防治各種蚜蟲、葉蟬、飛虱類、粉虱、線蟲、潛夜蛾以及多種地下害蟲，并且與吡蟲啉、啶蟲脒等農藥無交互抗性，被廣泛用于農作物莖葉處理、種子處理和土壤處理等。噻蟲嗪可選擇性抑制昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)煙酸乙酰膽堿酯酶受體，進而阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導，使害蟲麻痹及死亡，對水生生物、鳥禽、土壤微生物基本無毒。但有證據(jù)顯示，新煙堿類農藥對蜜蜂等授粉昆蟲生存造成威脅，并導致蜜蜂種群數(shù)量和聚居地減少[1]。隨著歐盟在2013年5月對3種新煙堿類種子處理農藥采取限制使用法規(guī)的實施[2]，噻蟲嗪農藥使用的健康風險和生態(tài)安全性問題受到了越來越多的關注。

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)又稱白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，有“世界菇”之稱，其菌絲還可作為制藥的原料。雙孢蘑菇在中國被廣泛栽培，栽培方式有菇房栽培、大棚架式栽培和大棚畦栽等。不同地區(qū)、不同氣候條件和不同季節(jié)可采取適合的栽培方式，在培育中主要使用吡蟲啉、噻蟲嗪等農藥進行害蟲防治。

目前，對噻蟲嗪殘留行為的研究主要集中于噻蟲嗪在蔬菜、水果及土壤中的殘留上[3-7]，而對噻蟲嗪在食用菌中殘留的研究很少。對噻蟲嗪殘留的檢測方法主要有毛細管電泳[8]、液相色譜[9]、液質聯(lián)用[10-11]等，這些方法提取、凈化步驟較多，比較繁瑣費時，消耗有機溶劑。本試驗擬采用乙腈溶解和分散固相萃取凈化的方法，一步完成噻蟲嗪的提取凈化，并與超高效液相色譜串聯(lián)質譜法 (ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS)配合檢測，減少溶劑使用量，以建立一種簡單且靈敏的方法測定雙孢蘑菇和土壤中噻蟲嗪的殘留。同時，研究在雙孢蘑菇栽培中使用25%噻蟲嗪水分散粒劑后，子實體中噻蟲嗪殘留動態(tài)和最終殘留，評估噻蟲嗪殘留的安全性，為今后噻蟲嗪在食用菌栽培中的合理使用以及制定噻蟲嗪在雙孢蘑菇中最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料1.1 供試菌株及培養(yǎng)料

雙孢蘑菇1640菌種由上海市農業(yè)科學院食用菌研究所提供。

培養(yǎng)料：選擇無農藥污染的供試培養(yǎng)料，試驗前檢測農藥殘留。稻草2 500 kg、菜籽餅200 kg、尿素25 kg、硫酸銨25 kg、過磷酸鈣50 kg、石膏62.5 kg、石灰75 kg。

1.2 主要藥劑與儀器

25%噻蟲嗪水分散粒劑(東莞市瑞德豐生物科技有限公司)；噻蟲嗪標樣(100 mgL)，上海市農藥研究所有限公司提供。甲醇(色譜純，美國Merck公司)；乙腈(色譜純，美國Merck公司公司)；無水硫酸鎂MgSO4(分析純)；N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑：粒徑40—60 μm；十八烷基硅烷(ODS)鍵合相吸附劑(C18)：粒徑40—60 μm。 LC-8030高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(配電噴霧離子源，LC-MS 8030,日本島津公司)；EC-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μm,美國Agilent公司)；超聲儀(中國Dragonlab公司)；離心機(Thermo-Fisher)。

1.2 雙孢蘑菇田間試驗

1.2.1 雙孢蘑菇栽培方法

試驗在上海市青浦區(qū)食用菌基地進行，雙孢蘑菇采用棚架覆土栽培，培養(yǎng)料經(jīng)過二次發(fā)酵后施用。栽培方法參照李可等[12-13]，小區(qū)面積30 m2。

1.2.2 消解試驗樣品制備

1.2.3 最終殘留試驗樣品制備

1.3 分析檢測方法

1.3.1 樣品提取與凈化

稱取5.00 g試樣于50 mL聚乙烯離心管中，加入20 mL乙腈溶液，分別渦旋提取和超聲提取5 min；再加入2—3 g氯化鈉，渦旋0.5 min,4 000 rmin離心5 min后，取1 mL上清液至分別稱有50 mg PSA、150 mg MgSO4、50 mg C18的2 mL離心管中；將離心管渦旋1 min，10 000 rmin離心2 min；取上清夜過0.2 μm有機相濾膜過濾，待測。

1.3.2 儀器檢測條件

1.3.2.1 液相色譜條件

1.3.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源 ESI；掃描方式：正離子源；毛細管電壓：3.00 kV；錐孔電壓：噻蟲嗪20 V；噻蟲胺16 V；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；氮吹氣流量：800 Lh；錐孔氣流量：50 Lh；檢測方式：多重反應監(jiān)測。

1.3.3 標準曲線制作

1.3.4 添加回收率與檢出限測定方法

1.4 安全性風險評估

農藥的膳食暴露和風險評估常采用食品中農藥殘留量乘以該食品的消費量，求得農藥殘留攝入量與風險評估參照劑量(ADI或ARfD)的比較值農藥膳食風險墑值RQ(risk quotient)評估[14]，計算公式如下：

RQ=∑[STMRi×Fi]×100[ARfD(ADI)×BW]

(1)

式中：STMRi為第i類初級食用農產品的規(guī)范試驗殘留中值,單位 mgkg；Fi(food consumption)為第i類食用農產品的消費量,單位 mgd；BW(body weight)為人群平均體重,單位 kg；ARfD(acute reference dose)為急性參考劑量,單位 mg(kg·BW)；ADI(acceptable daily intake)為每日允許攝入量,單位mg(kg·BW)。

當RQ≤1 時，表示其急性風險為可接受，RQ越小，風險越?。划擱Q>1 時，表示不可接受。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

噻蟲嗪標準品甲醇混合標準溶液標準曲線如圖1。噻蟲嗪標準曲線方程為：y= 1E+07x-51 846，相關系數(shù)R2=0.9993。

2.2 添加回收率與檢出限

三種濃度的噻蟲嗪平均回收率分別為89%、102%、103%，相對標準偏差RSD為8%、6%、7%，在農藥殘留分析允許范圍之內。雙孢蘑菇中噻蟲嗪農藥的最低檢出限為0.01 mgkg。

2.3 殘留消解動態(tài)

試驗結果表明，噻蟲嗪消解動態(tài)按制劑量0.075 g a.i.m2施藥后，在雙孢蘑菇中的降解基本符合一級指數(shù)降解曲線y=0.3875e-0.123x,R2=0.9164(圖2)。隨著時間的推移，殘留量持續(xù)減少，施藥后第5天，噻蟲嗪殘留減少36%以上，施藥后第7天，噻蟲嗪降解率達到了60%以上,施藥后第14天，降解率達到了80%以上。根據(jù)一級指數(shù)降階曲線計算，噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的平均半衰期為6.3 d。

圖1 噻蟲嗪標準曲線Fig.1 The standard curve of thiamethoxam

圖2 雙孢蘑菇中噻蟲嗪殘留的降解動態(tài)Fig.2 The degradation dynamis of thiamethoxam residuesin Agaricus bisporus

2.4 噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量

末次施藥后7 d、10 d、14 d時噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量為0.038—0.423 mgkg。我國尚未制定噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的最大殘留限量MRL值，本試驗推薦噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的MRL值為0.5 mgkg，安全間隔期為7d。

表1 噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量

2.5 最終殘留量的長期膳食攝入和慢性風險評估

規(guī)范殘留試驗雙孢蘑菇中噻蟲嗪的殘留中值是0.423 mgkg 。我國《食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2016)中制定噻蟲嗪的ADI值為0.02 mg(kg·BW)[15]。參照2016版《中國居民膳食指南》，我國人均膳食結構中淺色蔬菜的每日攝人量，成年人一般為150—250 g，我國居民的平均體重為63 kg。根據(jù)1.4中公式計算普通人群噻蟲嗪的每日攝入量為0.0001679 mg(kg·BW)，占日允許攝入量的0.8%左右，風險商值RQ小于1，認為該農藥殘留對一般人群健康的影響在一個可接受的風險水平。

3 結論

噻蟲嗪是一種全新結構的第二代煙堿類農藥，可防治雙孢蘑菇中蚊蠅類和蚜類等害蟲，具有更高的活性、更好的安全性、更廣的殺蟲譜及作用速度快、持效期長等特點，是有機磷類和有機氯類農藥較好的替代品。本試驗采用乙腈溶解和分散固相萃取凈化的方法,結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雙孢蘑菇中噻蟲嗪殘留含量，在0.01—0.10 mgkg添加范圍內，平均回收率均大于89%，相對標準偏差均小于8%，符合農藥殘留試驗準則的要求。噻蟲嗪消解動態(tài)按制劑量0.075 g a.i.m2施藥后，噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的平均半衰期為6.3 d。本試驗研究了不同采收間隔期7 d、10 d、14d時噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的最終殘留量，殘留范圍為0.038—0.423 mgkg。噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的MRL值我國尚未制定，根據(jù)試驗檢測結果，推薦噻蟲嗪在雙孢蘑菇中的MRL值為0.5 mgkg，安全間隔期為7d。

本研究顯示，根據(jù)試驗中噻蟲嗪的殘留中值計算普通人群噻蟲嗪的每日攝入量為0.0001679 mg(kg·BW)，占日允許攝入量的0.8%左右,認為該農藥殘留對一般人群健康的影響在一個可接受的風險水平。由于膳食攝入風險評估還存在一些不確定的因素，蘑菇中噻蟲嗪的應用沒有登記資料數(shù)據(jù)，我國也沒有國家最大殘留限量MRL標準，因此，其膳食風險性還需進一步確定。