鮮切西蘭花貯藏期病原菌分離鑒定及植物精油對(duì)其抑制效果

黃文部，馬菀笛，文 豪，曾 茜，何靖柳，秦 文*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

西蘭花（Brassica oleracea L. var. italica），又稱青花椰菜、綠花菜，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值[1]，是一種常見的優(yōu)質(zhì)蔬菜。經(jīng)過鮮切處理的西蘭花細(xì)胞破裂、營養(yǎng)物質(zhì)流失，對(duì)微生物抵抗能力下降，導(dǎo)致西蘭花切面褐變、花球黃化等品質(zhì)下降，從而縮短了貨架期。刁小琴等[2]分離鑒定出西蘭花黑斑病的病原菌為蕓苔生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola），與劉毅[3]的鑒定結(jié)果相同。接種該菌后，西蘭花花球開始黃化，葉綠素迅速降解，乙烯釋放量和呼吸速率顯著升高，由此可見，病原菌會(huì)嚴(yán)重影響西蘭花的貯藏品質(zhì)。

因此，通過一定保鮮技術(shù)抑制西蘭花病原菌的生長繁殖，能有效保證鮮切西蘭花貨架期間的貯藏品質(zhì)。植物精油，也稱揮發(fā)油，是一類安全無毒、具有一定抗菌性的天然保鮮劑[4]。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂、丁香、茴香、牛至、香茅精油對(duì)鏈格孢菌有較好的抑制作用，可通過破壞鏈格孢菌細(xì)胞膜的完整性和通透性來影響細(xì)胞的外滲率，從而抑制菌絲的生長[5-9]。Ayala-Zavala[10]、Feng Wu[11]等也分別發(fā)現(xiàn)百里香精油（Thymus vulgaris）和肉桂精油對(duì)抑制鏈格孢菌活性有較好的效果。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)從染病西蘭花表層分離到的微生物進(jìn)行純化，將純化后的微生物接種于健康西蘭花，進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)。對(duì)病原菌菌株的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列測序，通過該保守序列的進(jìn)化樹分析確定病原菌種屬。選用百里香、肉桂、丁香、茴香、牛至和香茅精油進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)及活體抑菌實(shí)驗(yàn)，旨在為鮮切西蘭花貯藏期天然殺菌保鮮劑的選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花（品種‘冬至綠’）（Brassica oleracea L.var. italica），采購自雅安市吉選超市。選擇花球整齊、色澤綠、花形好、花蕾小、大小基本一致的健康西蘭花和自然發(fā)病的西蘭花，運(yùn)回四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃的冰箱中預(yù)冷備用。

肉桂精油、丁香精油、茴香精油、牛至精油、香茅精油和百里香精油 吉安市國光香料廠；UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒、UNIQ柱式DNA膠回收試劑盒上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FR980凝膠成像儀 上海復(fù)日科技儀器有限公司；3730測序列分析儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied BioSystems公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SK8259真菌試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離

病原真菌的分離鑒定參考刁小琴[2]、杜小琴[12]等的方法。選取鮮切處理后腐爛變質(zhì)的切面按照病癥分組，采用組織分離法。剪取病健交接處約2 mm的組織，用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精表面消毒10 s后，用無菌水清洗3 次后置于PDA培養(yǎng)基，繼續(xù)純化至3 次連續(xù)純化過程無其他菌落出現(xiàn)。

1.3.2 致病性實(shí)驗(yàn)

將純化后的濃度為105CFU/mL微生物孢子懸液噴霧接種于鮮切西蘭花上。每組處理約10 朵花球，重復(fù)3 次，接種后的西蘭花用厚度為0.021 mm的聚乙烯保鮮膜單層包裝，于25 ℃暗培養(yǎng)（相對(duì)濕度為（85±5）%），觀察并記錄發(fā)病情況，顯癥后再次分離鑒定并與該組接種的微生物對(duì)比，形態(tài)學(xué)鑒定一致則確定為病原菌。

1.3.3 病原菌ITS序列分析

基因組DNA的提取按SK8259真菌試劑盒操作。測定已確定病原菌的ITS序列，通過進(jìn)化樹分析確定病原菌種屬，并以此為精油抑菌效果研究奠定基礎(chǔ)。測序所用菌絲于25 ℃條件下預(yù)先培養(yǎng)5 d，DNA的提取參照Landschoot等[13]的方法，ITS序列PCR擴(kuò)增引物為：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

PCR體系包括10 × buffer（內(nèi)含Mg2+）2.5 μL、dNTP 1 μL、正向引物10 μmol/L 0.5 μL、反向引物10 μmol/L 0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。所得ITS產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，用膠回收試劑盒回收純化，回收純化產(chǎn)物由生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。在GenBank進(jìn)行比對(duì)并收集相關(guān)菌種的ITS序列信息，用MEGA 5.02軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，大致確定病原所屬種屬，為有針對(duì)性地選擇抑菌劑提供依據(jù)。

1.3.4 抑菌率實(shí)驗(yàn)

抑菌實(shí)驗(yàn)參考杜小琴等[12]的方法，肉桂、丁香、茴香、牛至、百里香和香茅6 種精油在同一含量下（2.00 μL/mL）進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以體積分?jǐn)?shù)10%吐溫-80為溶劑，將配制好的1.50 mL 20.00 μL/mL精油溶液與已滅菌的13.50 mL培養(yǎng)基（約50 ℃）混勻之后倒入平板中，制成含有2.00 μL/mL精油的平板，以等體積的吐溫-80為對(duì)照，用無菌打孔器在病原菌（培養(yǎng)7 d）平板上打取直徑為6 mm的菌塊放入平板中央，25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑，按照下式計(jì)算抑制率，選擇抑制率較高的植物精油進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

以體積分?jǐn)?shù)10%吐溫-80為溶劑，最后培養(yǎng)基中精油的最終含量為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 μL/mL。每個(gè)平板加入0.5 mL孢子懸浮液（105CFU/mL），均勻涂布后于25 ℃條件下培養(yǎng)2 d，以抑制率100%的最低精油含量為其最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），繼續(xù)培養(yǎng)2 d，若仍不長菌，則為最低殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）[14]。以添加體積分?jǐn)?shù)10%吐溫-80組為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 植物精油對(duì)鮮切西蘭花花球黃化率和切面褐變率的影響

參照致病性實(shí)驗(yàn)對(duì)健康西蘭花進(jìn)行接種，接種后的西蘭花立即噴施精油溶液，于15 ℃下陰干至表面無液體，所選精油含量設(shè)置為2 MFC、3/2 MFC、MFC、1/2 MFC（表1），噴施量約為0.4 g/50 g，以體積分?jǐn)?shù)10%吐溫-80噴施處理組作為對(duì)照，立即將塑料盒用保鮮膜封閉起來，置于25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每天統(tǒng)計(jì)花球黃化率和切面褐變率，統(tǒng)計(jì)3 d，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表 1 體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Grouping for in vivo antimicrobial tests

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

根據(jù)科赫法則，從鮮切處理后腐爛變質(zhì)的西蘭花切面（圖1A1）分離、純化出2 種霉菌，回接致病（圖1A2）和再分離純化后，確定西蘭花的病原菌為其中的一種霉菌（霉菌2號(hào)），標(biāo)記為AB01。分離純化后在25 ℃培養(yǎng)8 d的菌落形態(tài)見圖1B1、B2，回接致病再分離純化于25 ℃培養(yǎng)8 d的菌落形態(tài)見1C1、C2，孢子見圖1B3、C3。

圖 1 西蘭花貯藏期病原菌分離、菌落形態(tài)和發(fā)病癥狀Fig. 1 Pathogen isolation, colonial morphology, and pathogenic symptom

AB01菌落近圓形，單菌落能擴(kuò)展至直徑7 cm，邊緣不規(guī)則，菌落正面培養(yǎng)4 d內(nèi)呈灰白色，4 d開始顏色加深，10 d之后為黑褐色，菌落反面培養(yǎng)初為淡黃色而后轉(zhuǎn)為黑褐色，菌絲為樹枝狀無隔長菌絲，分生孢子呈手雷狀。被感染西蘭花在25 ℃放置1 d，切面出現(xiàn)褐斑，2 d后出現(xiàn)菌絲，以花球尤為明顯，2 d后切面已基本褐變，與自然病變西蘭花癥狀相似。

ITS全序列分析結(jié)果表明，該病原菌與鏈格孢菌屬微生物保守序列相似度最高。該病原菌的ITS全序列NCBI登錄號(hào)為MF040794。

圖 2 Alternaria alternata AB01和相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Alternaria alternata AB01 and their relative strains

進(jìn)化樹（圖2）顯示，病原菌AB01與鏈格孢菌（Alternaria alternata）親緣關(guān)系較近，與喬木鏈格孢（Alternaria arborescens）、百日菊鏈格孢（Alternaria zinnia）也比較近，與皮思霉（Pithomyces chartarum）、齒毛菌（Chaetomium globosum）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此可以推斷，鮮切西蘭花病原菌AB01為鏈格孢菌。

2.2 植物精油對(duì)病原菌的體外抑菌效果

如圖3所示，培養(yǎng)3 d后，所有精油處理組均未見菌絲生長和蔓延，對(duì)照組菌絲蔓延，培養(yǎng)3 d時(shí)菌落直徑達(dá)到（27.58±2.24）mm。由此表明，6 種精油（2 μL/mL）對(duì)AB01都具有良好的抑菌效果。

圖 3 植物精油對(duì)鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑制效果Fig. 3 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

表 2 植物精油對(duì)鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑菌效果Table 2 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

選定6 種精油研究其對(duì)AB01的MIC和MFC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，對(duì)于MIC，肉桂精油（＜0.3 μL/mL）＜茴香精油（0.6 μL/mL）、牛至精油（0.6 μL/mL）＜丁香精油（0.9 μL/mL）、百里香精油（0.9 μL/mL）＜香茅精油（1.2 μL/mL）；對(duì)于MFC，肉桂精油（＜0.3 μL/mL）＜牛至精油（0.6 μL/mL）、茴香精油（0.6 μL/mL）＜丁香精油（1.2 μL/mL）＜百里香精油（＞1.8 μL/mL）、香茅精油（＞1.8 μL/mL）。綜合得出，肉桂精油對(duì)AB01的體外抑制效果最好，但更加準(zhǔn)確的抑菌含量需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。茴香和牛至精油對(duì)AB01的體外抑制效果較好，僅次于肉桂精油，香茅和百里香精油效果較差。

肉桂精油組最低含量（0.3 μL/mL）培養(yǎng)4 d仍未長菌，第二輪實(shí)驗(yàn)將肉桂精油的含量設(shè)置為0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 μL/mL，共6 個(gè)含量梯度，操作同1.3.5節(jié)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，肉桂精油對(duì)病原菌AB01的MIC和MFC分別為0.05 μL/mL和0.15 μL/mL。

表 3 肉桂精油對(duì)鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑菌效果Table 3 In vitro inhibitory effect of cinnamon oil on AB01

2.3 植物精油對(duì)病原菌的體內(nèi)抑菌效果

根據(jù)體外抑菌實(shí)驗(yàn)，選取肉桂、茴香和牛至精油，探究三者對(duì)接種AB01鮮切西蘭花的花球黃花率和切面褐變率的影響。結(jié)果如圖4A、B所示，雷達(dá)圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)越接近中心，表示黃化率（褐變率）越低。對(duì)比CK1和CK2發(fā)現(xiàn)，接種AB01顯著增大了花球黃化率，且CK1組貯藏3 d后，仍然有50%花球黃化，說明影響花球黃化的因素除了AB01，可能還有別的因素（如溫度等）；對(duì)比CK2和CK3發(fā)現(xiàn)，吐溫-80作為溶劑，對(duì)花球黃化率和AB01的致病過程沒有顯著作用。對(duì)比肉桂精油組（A1～A4）發(fā)現(xiàn)，低含量的肉桂精油（A4）對(duì)AB01的抑制效果較差，隨著肉桂精油含量的增加，對(duì)AB01的抑制效果增強(qiáng)（表3），但花球黃花率也有增加，說明過高含量（0.30 μL/mL）的肉桂精油會(huì)加速西蘭花花球的黃化，這與預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的植物精油在一定含量時(shí)會(huì)造成鮮切西蘭花部分黃化相吻合，肉桂精油以0.15 μL/mL（MFC）效果最佳；茴香精油組（B1～B4）中，B3和B4處理沒有明顯效果，B2（3/2MFC）處理效果最佳，抑菌含量比體外抑制實(shí)驗(yàn)要高一些；牛至精油組（C1～C4）中，含量為0.9 μL/mL和0.6 μL/mL時(shí)效果最好，二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖 4 精油處理對(duì)鮮切西蘭花花球黃化率（A）和切面褐變率（B）的影響Fig. 4 Effect of essential oil treatment on etiolation (A) and browning (B) in fresh-cut broccoli

切面褐變是鮮切西蘭花被AB01侵染的主要表現(xiàn)，因此可用切面褐變率代表發(fā)病率，從而反映植物精油的體內(nèi)抑菌效果。西蘭花接種AB01后于25 ℃培養(yǎng)2 d，切面基本褐變（CK2），而無菌對(duì)照組（CK1）切面保持新鮮顏色。對(duì)比花球黃化，AB01對(duì)于鮮切西蘭花切面褐變的影響更加明顯。對(duì)比CK2和CK3發(fā)現(xiàn)，吐溫-80對(duì)切面褐變沒有顯著作用。對(duì)于肉桂精油組（A1～A4），規(guī)律與花球黃化率實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，最優(yōu)含量為0.15 μL/mL，培養(yǎng)3 d時(shí)，切面褐變率僅為50.00%。對(duì)于茴香精油組（B1～B4），培養(yǎng)2 d時(shí)，B1和B2處理效果較好，但培養(yǎng)3 d時(shí)，4 組西蘭花切面均全部褐變；對(duì)于牛至精油組（C1～C4），培養(yǎng)2 d時(shí)，4 組精油抑制褐變效果均較好，培養(yǎng)3 d時(shí)，4 組西蘭花切面亦全部褐變。因此，從抑制西蘭花切面褐變角度而言，肉桂精油更適合用于鮮切西蘭花的保鮮。綜合花球黃化率和切面褐變率可得，肉桂精油比牛至精油、茴香精油更適合在鮮切西蘭花保鮮上使用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同精油對(duì)于鏈格孢菌A B 0 1的抑制效果。6 種植物精油對(duì)AB01的MFC以肉桂精油最低（0.15 μL/mL），其次是茴香和牛至精油（0.6 μL/mL），丁香和百里香精油較高，香茅精油最高，為1.2 μL/mL。

對(duì)于丁香和百里香精油的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，楊婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)百里香酚和丁香酚對(duì)鏈格孢菌的抑制效果有限；解淑慧等[16]發(fā)現(xiàn)丁香精油可以抑制柑橘采后柑橘鏈格孢（Alternaria citri）和指狀青霉（Penicillium digitatum）的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）[14]，細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、粉紅單端孢霉（Trichothecium roseum）4 種菌中，百里香對(duì)細(xì)極鏈格孢的抑制效果最差（半抑制濃度43.6 μL/L）[17]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似，說明百里香精油和丁香精油雖然具有抑菌效果，但對(duì)鏈格孢菌的抑制效果有限。紀(jì)淑娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)0.5 μL/mL的香茅精油可以有效抑制鏈格孢菌菌絲生長，與本研究結(jié)果（1.2 μL/mL）不同，可能與精油純度和菌種來源有關(guān)。

對(duì)于肉桂和牛至精油的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，李亞茹等[19]研究發(fā)現(xiàn)肉桂和茴香精油對(duì)鏈格孢菌的MIC分別為0.08、1.20 μg/mL；兩種精油都顯著優(yōu)于卡那霉素對(duì)鏈格孢菌的抑制效果（MIC 800 μg/mL）。蔣妮等[20]研究發(fā)現(xiàn)0.50 mg/mL的肉桂精油對(duì)鏈格孢菌菌絲的抑制率為100%，對(duì)孢子萌發(fā)率的抑制率高于90%。Kiran等[21]發(fā)現(xiàn)肉桂精油的MIC是0.40 μL/mL，高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果（0.15 μL/mL），本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.30 μL/mL的肉桂精油可以完全抑制AB01的生長，因此進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得到肉桂精油對(duì)AB01的MIC的差異可能與精油純度、菌種來源有關(guān)。Zabka等[14]研究發(fā)現(xiàn)牛至和百里香精油對(duì)鏈格孢菌的MIC分別為0.092 μL/mL和0.146 μL/mL，可見牛至精油的抑菌效果優(yōu)于百里香精油。Castro等[22]研究植物精油對(duì)于火龍果源鏈格孢菌的抑菌效果，肉桂（MIC 250 μg/mL）優(yōu)于丁香精油（MIC 500 μg/mL）和香茅精油（MIC 1 000 μg/mL），與本研究結(jié)果相同。因此，肉桂精油和牛至精油不僅對(duì)鏈格孢菌具有良好的抑制效果，對(duì)灰葡萄孢菌[23-24]、鐮刀菌[25]、青霉菌[26]和曲霉屬真菌[27]等的抑制效果也均良好，說明肉桂精油和牛至精油具有廣譜抑菌作用。

同時(shí)，肉桂精油比牛至精油表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果，與其揮發(fā)效果有關(guān)，F(xiàn)rankova等[28]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)蘋果源鏈格孢菌的抑菌效果最強(qiáng)（MIC 32 μL/mL），香茅精油最差（MIC 256 μL/mL），與本研究結(jié)果一致。但是熱風(fēng)協(xié)同植物精油進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)牛至精油表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果（MIC 2 μL/mL）。說明常溫下肉桂精油比牛至精油更易揮發(fā)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果。同時(shí)經(jīng)肉桂精油處理的西蘭花花球黃化率和切面褐變率也是最低的，證實(shí)了AB01能夠加速鮮切西蘭花的腐敗變質(zhì)，肉桂精油可以通過抑制AB01的生長繁殖進(jìn)而延緩西蘭花的品質(zhì)下降。

因此，本實(shí)驗(yàn)從鮮切西蘭花自然感病部位分離出的AB01真菌菌株表現(xiàn)出致病性，通過ITS序列分析和進(jìn)化樹繪制比對(duì)發(fā)現(xiàn)病原菌為鏈格孢菌，NCBI登錄號(hào)為MF040794，與刁小琴[2]、劉毅[3]等分離鑒定出的病原菌同屬不同種，說明不同地區(qū)的西蘭花其病原菌不同，具有一定研究價(jià)值。在已知對(duì)鏈格孢菌屬有較強(qiáng)抑制作用的6 種精油中，AB01對(duì)肉桂精油最敏感，MIC和MFC分別為0.05 μL/mL和0.15 μL/mL，其次是牛至精油和茴香精油?；铙w抑菌實(shí)驗(yàn)中0.15 μL/mL的肉桂精油噴施處理能降低接種AB01菌株西蘭花的花球黃花率和切面褐變率；因此，認(rèn)為肉桂精油是一種適用于鮮切西蘭花的天然保鮮劑。天然保鮮劑越來越被廣泛應(yīng)用于鮮切果蔬保鮮，將肉桂精油應(yīng)用于鮮切西蘭花上，不僅生產(chǎn)操作方便，而且保鮮劑天然安全，具有一定應(yīng)用價(jià)值。