鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落組成和代謝功能的比較分析

程三紅，湯海青，歐昌榮,*，張夢思，昝春蘭，李亞敏

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校食品學(xué)院，浙江 寧波 315100）

魚類由于高營養(yǎng)、高水分及接近中性的pH值特點使其在流通運輸中極易受微生物活動和代謝的影響而腐敗變質(zhì)[1]。鮮活健康的魚類肌肉組織內(nèi)部無菌，但在其體表、腮和消化道內(nèi)存在大量微生物，魚類死亡后，這些微生物逐漸侵入魚體進行繁殖和代謝，產(chǎn)生氨、胺類、硫化物、酯、酮、醛和揮發(fā)性脂肪酸等物質(zhì)，引起魚體腐敗[2]。據(jù)文獻報道，對魚類腐敗起主導(dǎo)作用的微生物通常只有一種或幾種，即特定腐敗菌[3]。目前，魚類特定腐敗菌的研究多集中在肌肉微生物方面[4-5]，關(guān)于其體表微生物的研究則相對較少。然而，研究表明，魚類體表微生物對魚體腐敗起著至關(guān)重要的作用[6]。因此，分析魚類體表微生物組成及其代謝功能的變化對控制魚類腐敗具有重要意義。

隨著科技的進步，以Illumina、Roche 454和Ion Torrent等測序系統(tǒng)為代表的高通量測序技術(shù)快速發(fā)展[7]，已成為微生物群落研究的重要工具。部分學(xué)者將其應(yīng)用于熏鮭魚[8]、黃鰭金槍魚[9]、牡蠣[10]和蝦[11]等水產(chǎn)食品微生物群落的研究，以揭示水產(chǎn)食品的優(yōu)勢腐敗微生物。但國內(nèi)外利用該技術(shù)對魚類體表微生物進行的研究卻比較少見。

此外，現(xiàn)有研究主要關(guān)注魚類腐敗細菌群落組成，缺乏其代謝相關(guān)的功能信息。PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是一項基于16S序列預(yù)測細菌群落功能的軟件[12]。Stellato等[13]采用PICRUSt對肉類及其相關(guān)的環(huán)境樣本細菌群落進行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)細菌群落和預(yù)測的代謝功能之間具有相關(guān)性。Ferrocino等[14]對不同包裝的牛肉漢堡微生物進行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)采用乳酸鏈球菌素抗菌包裝能夠降低樣品中腐敗相關(guān)的代謝功能基因的豐度，延長產(chǎn)品的貨架期。由此可見，采用PICRUSt功能預(yù)測可以將細菌群落與其代謝功能聯(lián)系起來，更好地闡述食品加工貯藏過程中細菌群落組成、代謝功能和腐敗變質(zhì)之間的關(guān)系。

鮐魚（Pneumatophorus japonica）和大黃魚（Pseudosciaena crocea）是我國重要的海水經(jīng)濟魚類，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，在水產(chǎn)市場占有較大份額。然而，鮐魚屬于紅肉魚類，大黃魚屬于白肉魚類，紅肉魚為適應(yīng)持續(xù)的洄游運動，常含有較多的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和酶等。因此，同一貯藏條件下，鮐魚往往比大黃魚更容易受生理生化和微生物等因素影響而腐敗變質(zhì)[15]。鑒于此，本實驗選取鮐魚和大黃魚為研究對象，采用Illumina MiSeq測序技術(shù)和PICRUSt功能預(yù)測來比較分析鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落和代謝功能的差異，揭示兩種魚的特定腐敗微生物，并探討鮐魚更容易腐敗的原因，以期為靶向抑制水產(chǎn)品的腐敗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮐魚和大黃魚由寧波夢婕食品有限公司提供。其中，鮐魚（體質(zhì)量250～300 g，體長25～30 cm）捕獲于中國東海海域，大黃魚（體質(zhì)量400～450 g，體長30～35 cm）為寧波象山港海域深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚。

細菌基因組DNA快速提取試劑盒、λ DNA/Hind Ⅲ北京天根公司；Gelview核酸染料 北京百泰克公司；6×Loading Buffer、瓊脂糖 北京全式金公司；溶菌酶、50×TAE 北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)、新JY300C電泳儀、JY-SPCT電泳槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ND-1000分光光度計 美國Thermo Scientific公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

鮐魚和大黃魚捕獲后，在船上用無菌袋單獨包裝，層冰層魚置于冰盒中12 h內(nèi)運送至實驗室，分別隨機分成4 組，于4 ℃冰箱冷藏。取樣測定時間分別為第0、3、6、9天（鮐魚和大黃魚分別記為：T0、T3、T6、T9和H0、H3、H6、H9），每個取樣點各取6 尾鮐魚和大黃魚進行平行實驗。

1.3.2 TVB-N含量的測定

參照國家水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[16]測定揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的含量，取魚體背部肌肉進行測定，每個樣品做3 個平行。

1.3.3 基因組DNA提取

魚類體表微生物收集參考Ozaktas等[17]的方法進行。用無菌棉球沿魚體背部中線長度約8 cm的表皮進行擦拭，兩側(cè)擦拭面積共約30 cm2，同時避開腹部和腮部以免腸道和腮部微生物污染。將棉球置于10 mL無菌離心管中，加入2 mL 8.5 g/L無菌生理鹽水，高速漩渦2 min，吸出菌懸液置于2 mL離心管中，4 ℃、10 000×g離心20 min，收集沉淀。用細菌基因組DNA提取試劑盒按照說明書進行DNA提取。質(zhì)量分數(shù)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，ND-1000分光光度計測定DNA濃度和純度。DNA樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR擴增和測序

使用1 6 S r R N A基因引物3 4 1 F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）對細菌16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

PCR條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個樣品設(shè)計3 個平行進行PCR擴增以減少擴增造成的偏差。經(jīng)凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物片段大小符合預(yù)期結(jié)果，且沒有非特異性條帶，用PCR片段純化試劑盒純化。使用ND-1000分光光度計測定濃度，每個樣品取等量的PCR產(chǎn)物混合，用Illumina MiSeq測序平臺測序。

1.3.5 測序數(shù)據(jù)處理

運用FLASH軟件（version1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對原始數(shù)據(jù)進行拼接；使用QIIME（version 1.9.0，http://qiime.org/）進行質(zhì)控和去除嵌合體序列（Chimera sequence）[18]，用Uclust在97%相似性水平上將序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[19]；選取豐度和覆蓋度最高的序列作為每個OTU的代表序列，用PyNAST在Greengenes數(shù)據(jù)庫中比對進行物種注釋[20]；去除古菌、葉綠體和非細菌序列及僅有一條序列的OTUs[21]。為消除樣品間由于測序深度不同造成的偏差，對每個樣品隨機選取23 330 條（最低測序深度）序列用于后續(xù)分析。利用PICRUSt （http://picrust.github.io/picrust/）工具將OTU表標(biāo)準化并與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫比對進行功能預(yù)測分析[12]。

1.4 統(tǒng)計分析

用QIIME軟件計算Chao 1和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)；用R軟件（v.3.1.1）中vegan軟件包計算細菌群落香農(nóng)指數(shù)；參考Andersson等[22]計算測序深度指數(shù)；使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和獨立樣本t檢驗；利用PAST軟件基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）評估各樣本細菌群落的差異性；利用PAST軟件的群落相似性分析檢測兩種魚體表菌群結(jié)構(gòu)的差異及差異顯著性[23]。利用Pearson相關(guān)性分析篩選與TVB-N含量相關(guān)的細菌屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌群落多樣性分析

對48 個樣本DNA進行PCR擴增、測序。其中，H0樣品經(jīng)PCR后未能擴增出目標(biāo)條帶，可能是由于冷藏初期大黃魚體表細菌較少，導(dǎo)致提取的DNA濃度過低或者未抽提出；因此在后續(xù)數(shù)據(jù)處理中去除了對H0樣品的分析。其他42 個樣品經(jīng)拼接、過濾處理后，共得到1 308 492 條序列，平均每個樣本得到（31 154±2 760）條序列。每個樣品隨機選取23 330 條序列計算鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落豐富度和多樣性（表1）。Chao1指數(shù)表征物種豐富度，Chao1指數(shù)越大，物種豐富度越高；觀察到的物種數(shù)表征樣品中含有的物種數(shù)目，觀察到的物種數(shù)值越大，物種豐富度越高；香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)則表征菌群多樣性，其值越大，群落多樣性就越高。結(jié)果表明，鮐魚體表細菌群落的Chao1指數(shù)和觀測到的物種數(shù)總體上均隨冷藏時間的延長而上升，但其細菌群落的香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)則隨冷藏時間的延長而顯著下降（P＜0.05）；從冷藏第3～9天，大黃魚體表細菌群落的Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)變化均不顯著（P＞0.05）。本研究中，所有樣本測序深度指數(shù)均在97%以上，說明測序結(jié)果能夠反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

表 1 單因素方差分析鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落多樣性Table 1 One-way ANOVA analysis for the diversity of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)和組成分析

在門水平上，鮐魚和大黃魚體表細菌主要隸屬于6 個門（圖1a，平均相對豐度均大于1%）。其中，變形菌門（Proteobacteria）在兩種魚體表均占優(yōu)勢地位，其次是厚壁菌門（Firmicute）。變形菌門相對豐度在鮐魚體表隨冷藏時間的延長而上升，冷藏末期達到99.8%，但在大黃魚體表卻呈下降趨勢；與之相反，厚壁菌門相對豐度在鮐魚冷藏前期處于較高水平，后期則急劇下降，但在大黃魚體表卻隨冷藏時間的延長呈上升趨勢。

在屬水平上，鮐魚和大黃魚體表菌相差異較大（圖1b，平均相對豐度均大于1%）。冷藏初期，鮐魚體表菌相以嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為主。冷藏過程中，鮐魚和大黃魚體表優(yōu)勢細菌分別以嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬（Shewanella）為主。嗜冷桿菌屬在鮐魚體表始終處于絕對優(yōu)勢地位，并隨冷藏時間的延長而上升；希瓦氏菌屬在大黃魚冷藏第3～6天大幅上升，其后略微下降。鮐魚體表次要微生物為葡萄球菌屬和不動桿菌屬（Acinetobacter）等。葡萄球菌屬和不動桿菌屬在鮐魚冷藏前期有較高分布，后期則處于較低水平。大黃魚體表次要細菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium），僅在大黃魚冷藏第3天有較高分布，后期逐漸下降。其他細菌屬在鮐魚和大黃魚冷藏期間相對豐度始終處于較低水平。

圖 1 鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌在門（a）和屬（b）水平上的平均相對豐度Fig. 1 Average relative abundance of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker at the phylum (a) and genus (b) levels during refrigerated storage

利用PCoA分析鮐魚和大黃魚體表細菌群落結(jié)構(gòu)差異，圖中各樣品之間的相對距離能夠反映其細菌群落的相似程度，距離越近，相似性越高，結(jié)果顯示不同魚種之間的體表菌群差異性總體上隨冷藏時間的延長而逐漸增加（圖2a）。此外，同種魚的6 個平行樣本之間的體表菌群差異性卻隨冷藏時間的延長逐漸減?。▓D2b、c）。細菌群落相似性檢驗表明鮐魚和大黃魚之間的體表細菌群落組成具有高度顯著差異（P＜0.001）；冷藏期間，除鮐魚樣品在0 d和3 d之間以及大黃魚在6 d和9 d之間差異不顯著外，同種魚的其他樣品之間均具有極顯著差異（P＜0.01）（表2）。

圖 2 鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落主坐標(biāo)分析Fig. 2 Principal coordinate analysis for bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

表 2 基于Bray-Curtis距離的鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落差異性分析Table 2 Community dissimilarity based on the analysis of similarity using Bray-Curtis distance of bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

2.3 與TVB-N含量相關(guān)的細菌篩選

圖 3 鮐魚和大黃魚冷藏期間TVB-N含量的變化Fig. 3 Change in TVB-N contents of mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

如圖3所示，整個冷藏期間鮐魚和大黃魚TVB-N含量均隨冷藏時間的延長呈上升趨勢，且鮐魚的TVB-N含量極顯著高于同一冷藏時期的大黃魚（P＜0.001）。冷藏末期鮐魚TVB-N含量已超出GB 2733—2015《食品安全國家標(biāo)準 鮮、凍動物性水產(chǎn)品》中規(guī)定的海水魚的最高限值（30 mg/100 g）[24]，而大黃魚仍處于限值范圍內(nèi)?？梢姡焕洳貤l件下鮐魚比大黃魚更易分解產(chǎn)生TVB-N，腐敗速度更快。

表 3 鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落相對豐度 與TVB-N含量相關(guān)性Table 3 Correlation between relative abundance and TVB-N content on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

在屬水平利用Pearson相關(guān)性分別檢驗鮐魚和大黃魚體表細菌群落相對豐度與TVB-N含量的相關(guān)性，挑出相對豐度＞1%、r＞0.5且P＜0.05的TVB-N相關(guān)細菌，結(jié)果見表3。鮐魚體表篩選到與TVB-N含量顯著相關(guān)的細菌共10 種，其中與TVB-N含量呈正相關(guān)的有嗜冷桿菌屬和弧菌屬。大黃魚體表篩選到與TVB-N含量顯著相關(guān)的細菌共2 種，其中與TVB-N含量呈正相關(guān)的主要是希瓦氏菌屬。

2.4 PICRUSt功能預(yù)測

將鮐魚和大黃魚體表細菌群落進行PICRUSt功能預(yù)測，共獲得296 種預(yù)測功能基因，其中與代謝相關(guān)的基因主要是氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、輔酶因子及維生素代謝、脂質(zhì)代謝和核酸代謝相關(guān)基因等。線性回歸分析顯示，鮐魚（r＝0.809，P＜0.001）和大黃魚（r＝0.771，P＜0.001）的體表細菌群落相似性與功能相似性之間均顯著正相關(guān)（圖4）。將氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的相對豐度分布特征繪制成熱圖（圖5）（平均相對豐度＞0.1%），發(fā)現(xiàn)鮐魚和大黃魚體表細菌代謝相關(guān)基因基本能夠按照不同魚種聚成兩類，但鮐魚在冷藏0 d時與大黃魚聚成一類，這表明冷藏初期鮐魚體表細菌代謝相關(guān)基因的相對豐度與大黃魚類似，但中后期則差異較大。冷藏期間，鮐魚和大黃魚體表均有氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的分布，且氨基酸代謝相關(guān)基因的相對豐度占據(jù)比例最大。鮐魚體表細菌的半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等參與氨基酸代謝的基因相對豐度總體上隨冷藏時間的延長而上升，而大黃魚則表現(xiàn)出下降趨勢。此外，鮐魚體表細菌的蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸等絕大部分參與氨基酸代謝相關(guān)基因的相對豐度顯著高于同一冷藏時期的大黃魚（P＜0.05）。

圖 4 鮐魚（a）和大黃魚（b）冷藏期間體表細菌群落相似性與功能相似性的擬合相關(guān)性Fig. 4 Correlation between composition and functional similarity of bacterial communities on mackerel (a) and large yellow croaker (b)during refrigerated storage

圖 5 鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落的氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因豐度分布熱圖Fig. 5 Heatmap of the abundance of genes related to amino acid metabolism, lipid metabolism, and carbohydrate metabolism in bacterial communities on mackerel and large yellow croaker during refrigerated storage

3 討 論

高通量測序技術(shù)能夠更真實、更全面地反映樣本中微生物群落信息，本研究采用Illumina測序技術(shù)和PICRUSt功能預(yù)測比較分析了鮐魚和大黃魚冷藏期間體表細菌群落組成和代謝功能的差異。冷藏期間鮐魚體表細菌群落的Chao1指數(shù)和觀測到的物種數(shù)均隨冷藏時間的延長而增加，香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)卻下降，說明隨冷藏時間的延長，鮐魚體表細菌群落豐富度上升，多樣性卻下降，表面細菌主要由優(yōu)勢菌構(gòu)成，這可能是菌群間的競爭和抑制作用所致[25]。大黃魚在冷藏第0天未能抽提到DNA，可能是因為海水中微生物濃度較低，同時其體表黏液中含有凝集素、溶菌酶和抗菌肽等抗菌成分[26]。大黃魚從冷藏第3～9天體表細菌群落的Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)變化均不顯著，說明其體表菌群豐富度和多樣性在該時期相對穩(wěn)定。

在門水平上，鮐魚和大黃魚體表主要優(yōu)勢菌為變形菌門。類似的，Larsen等[27]對6 種墨西哥灣魚類體表微生物進行研究，也發(fā)現(xiàn)變形菌門是其體表優(yōu)勢菌。變形菌門廣泛分布于海洋環(huán)境中，而魚類體表細菌主要來自其周圍的水生環(huán)境[28]。本研究中，大黃魚采用深水網(wǎng)箱模式進行養(yǎng)殖，其生存環(huán)境高度模擬海水環(huán)境。因此，在細菌門水平，其體表菌相和鮐魚等海水魚類相似。

在屬水平上，兩種魚體表菌相差異較大。冷藏期間鮐魚體表優(yōu)勢菌始終以嗜冷桿菌屬為主。嗜冷桿菌屬是典型的耐寒性細菌，在多種水產(chǎn)品中均有檢出[29]。本研究中，嗜冷桿菌屬的相對豐度與鮐魚TVB-N含量顯著正相關(guān)。張雯[30]通過對無菌魚肉進行接種研究，發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌屬中的靜止嗜冷桿菌（Psychrobacter immobilis）具有產(chǎn)三甲胺（trimethylamine，TMA）和TVB-N的能力。由此推測，嗜冷桿菌屬可能是鮐魚體表的特定腐敗菌。此外，鮐魚體表的弧菌屬也與其TVB-N含量顯著正相關(guān)，弧菌屬種類較多，分解蛋白能力較強[10]，但弧菌屬多屬于嗜溫菌，低溫能夠抑制嗜溫菌的生長。因此，弧菌屬在冷藏期間相對豐度始終處于較低水平[31]。根據(jù)這一結(jié)果，在鮐魚加工貯藏過程中，可采用抑制嗜冷桿菌屬繁殖的方法對其進行處理，從而延長鮐魚貨架期。例如：張雯等[32]通過對峙實驗和擴散抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS08對分離自魚體的嗜冷桿菌屬具有強烈抑制作用。因此，可采用該益生菌對鮐魚進行處理來延緩魚體腐敗。

從冷藏第3～9天，大黃魚體表主要優(yōu)勢細菌為希瓦氏菌屬，這可能與希瓦氏菌屬具有較強的低溫耐受性有關(guān)[33]。希瓦氏菌屬是海水魚類常見的腐敗菌[34]。大量研究表明，希瓦氏菌屬能還原氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO）為TMA，并能生成H2S，使魚體出現(xiàn)酸臭味[3]。本研究中，希瓦氏菌屬的相對豐度亦與大黃魚TVB-N含量呈顯著正相關(guān)；因此，希瓦氏菌屬可能是大黃魚體表的特定腐敗菌。值得注意的是，本研究中，嗜冷桿菌屬與鮐魚TVB-N含量表現(xiàn)出正相關(guān)性，卻與大黃魚TVB-N含量表現(xiàn)出負相關(guān)性，這可能是因為鮐魚體表嗜冷桿菌屬具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力，因而其相對豐度隨冷藏時間的延長逐漸上升；相反的，大黃魚體表嗜冷桿菌屬在冷藏中后期可能受到乳酸菌分泌的過氧化氫、乳酸和細菌素等抗菌物質(zhì)的抑制[35]，其相對豐度隨冷藏時間的延長而下降。為延長大黃魚的貨架期，可針對希瓦氏菌屬采取一些抑菌措施。例如：He Mu等[36]采用10 g/L殼聚糖和6 g/L Nisin結(jié)合的保鮮劑對大黃魚魚肉進行浸泡處理，發(fā)現(xiàn)該保鮮劑能有效抑制魚肉中希瓦氏菌的生長和生物膜的形成，從而減少魚肉氨基酸的分解及腐敗產(chǎn)物的生成，達到保鮮效果。

魚類腐敗細菌的繁殖常伴隨著大量代謝產(chǎn)物的生成；因此，魚類菌群結(jié)構(gòu)在魚體代謝產(chǎn)物形成方面起著重要作用。某些微生物在功能上有一定的相似性，當(dāng)其中一種或幾種微生物被去除后，細菌群落功能能基本保持不變，即微生物群落存在功能冗余[37]。本研究中，兩種魚體表細菌群落相似性與功能相似性之間均顯著正相關(guān)，表明菌群功能冗余度相對較低[38]。鮐魚體表細菌的氨基酸代謝相關(guān)基因的相對豐度隨冷藏時間的延長而增加，大黃魚卻呈現(xiàn)出相反趨勢，這可能與兩種魚體表細菌代謝能力隨冷藏時間的延長而有不同的變化有關(guān)。冷藏初期，鮐魚處于僵硬期，魚肉pH值下降，酸性環(huán)境不適宜細菌的繁殖代謝，中后期隨著氨和胺類堿性物質(zhì)的累積，pH值上升，細菌的分解代謝能力逐漸增強[15]；而大黃魚體表細菌在冷藏中后期可能受到乳酸菌的抑制，分解代謝能力逐漸減弱[35]。同時這也解釋了冷藏第0天鮐魚體表細菌代謝相關(guān)基因的相對豐度與大黃魚類似，中后期則差異較大的原因。

魚肉的腐敗主要與蛋白質(zhì)、氨基酸等的分解有關(guān)。在細菌作用下，蛋氨酸和酪氨酸分解易生成含氮物質(zhì)，使魚體TVB-N含量升高[39]；組氨酸分解則生成組胺，影響魚類食用安全[5]；色氨酸分解生成吲哚、甲基吲哚等，使魚體產(chǎn)生異味[40]。一方面，鮐魚體表細菌的蛋氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等絕大部分參與氨基酸代謝的相關(guān)基因的相對豐度顯著高于同一冷藏時期的大黃魚；另一方面，鮐魚皮膚細薄、易破肚，體表細菌極易侵入，且肌肉松軟，富含組氨酸等游離氨基酸[15]。因此，當(dāng)鮐魚體表細菌侵入內(nèi)部后，其氨基酸更易分解代謝產(chǎn)生TVB-N和組胺等不良物質(zhì)，使魚體腐敗。研究表明，鮐魚屬于典型的高組胺魚類[5]，本研究中鮐魚體表組氨酸代謝相關(guān)基因的相對豐度顯著高于大黃魚，這與鮐魚更易產(chǎn)生組胺的特性一致。說明PICRUSt功能預(yù)測軟件在組胺相關(guān)菌的研究上表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，可為組胺相關(guān)菌的研究提供新思路，相關(guān)研究值得進一步探討。此外，鮐魚體表的脂質(zhì)和碳水化合物代謝相關(guān)基因的相對豐度也較高。在相關(guān)微生物作用下，鮐魚比大黃魚更易進行脂質(zhì)和碳水化合物代謝產(chǎn)生醛、酮和酸等物質(zhì)[41]，使魚體產(chǎn)生腥臭味，品質(zhì)劣化。

4 結(jié) 論

冷藏期間，鮐魚體表細菌群落的豐富度隨冷藏時間的延長而增加，多樣性卻下降；大黃魚體表細菌群落的豐富度和多樣性變化均不顯著。鮐魚和大黃魚體表的特定腐敗菌可能分別是嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬。與大黃魚相比，鮐魚體表細菌具有更高豐度的蛋氨酸、酪氨酸和組氨酸等參與氨基酸代謝的相關(guān)基因，這在一定程度上從微生物代謝水平解釋了鮐魚比大黃魚更易腐敗的原因。本研究可為魚類針對性的貯藏保鮮技術(shù)的開發(fā)提供參考，為水產(chǎn)品加工貯藏過程中微生物組成及代謝功能變化的研究提供新思路。