不同溶氧量下功率超聲波控制成核對過氧化氫酶溶液冷凍干燥的影響

周新麗，申炳陽，張三強

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

真空冷凍干燥過程可以概括為3 個主要步驟：物料中的水分被凍結，冰在一次干燥過程中升華，非冷凍水在二次干燥過程中解吸[1-4]。雖然冷凍在整個冷凍干燥過程中經(jīng)歷時間很短，但其決定了形成冰的形態(tài)、大小、分布，對后期的升華、解吸速率以及凍干產(chǎn)品的質(zhì)量（品相、孔隙率、蛋白質(zhì)聚集等）影響很大。小的冰晶不利于冰的升華干燥，但冰晶越小，干燥后物料質(zhì)構變化越小[5-10]。

雖然冷凍干燥中冷凍的重要性已經(jīng)受到重視，但水轉(zhuǎn)化成冰這一關鍵點不能直接控制，成核是隨機自發(fā)的過程，形成的冰晶大小具有隨機分布的特點。近些年一些研究證明，功率超聲波在溶液中傳播時，引起的多種物理、化學效應會對冰結晶產(chǎn)生影響，其中空化效應對冰結晶的影響比較顯著，一方面有利于冰結晶過程中晶核的生成；另一方面能夠促進凍結過程中的傳熱、傳質(zhì)，進而促進冰晶體的生長[11-14]。基于此基本原理，功率超聲技術在食品冷凍各方面的應用已經(jīng)被報道，包括初始成核、控制冰晶體的尺寸、加快凍結速率以及改善冷凍食品的品質(zhì)[15-16]。Kiani等[17]發(fā)現(xiàn)，超聲波能在不同的溫度（-5.4～-1.2 ℃）下觸發(fā)冰晶成核，并在不同的超聲波觸發(fā)溫度下，冰晶成核溫度都具有高度的可重復性，超聲波觸發(fā)溫度與成核溫度之間呈線性關系（R2＝0.96）。Nakagawa等[18]發(fā)現(xiàn)，超聲波在較高溫度下觸發(fā)溶液成核可以獲得較大的冰晶，利用此性質(zhì)提高了冷凍干燥的干燥速率。Hu Fen[19]、Jabbari-Hichri[20]等研究超聲輔助凍結含氣溶液時發(fā)現(xiàn)，氣體含量對超聲波控制成核形成的冰晶大小分布有明顯影響，液體中充入氣泡是提高超聲輻照啟動成核的一種可行方法。Jabbari-Hichri等[20]在研究一系列不同含氣量的甘露醇溶液經(jīng)超聲波控制成核時，發(fā)現(xiàn)在相同的超聲強度下形成的冰晶大小分布和冰晶的平均大小均有顯著差異，含氣量高的溶液獲得的冰晶較為均勻。王成會等[21]在研究空化對液體傳聲特性的影響時發(fā)現(xiàn)，液體內(nèi)預先存在的氣泡會對聲衰減系數(shù)和聲速產(chǎn)生的影響很大。

本研究主要以1 mg/mL過氧化氫酶（catalase，CAT）作為模式蛋白，加入質(zhì)量分數(shù)10%的蔗糖溶液和質(zhì)量分數(shù)10%的甘露醇溶液（分別作為冷凍保護劑和賦形劑），將5 種溶氧水平CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核并冷凍干燥，分析水分質(zhì)量分數(shù)、孔隙率以及酶活力回收率，探討充氣法對提高超聲波控制成核輔助冷凍干燥的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CAT（牛肝） 美國Sigma公司；超純水 實驗室自制；蔗糖、甘露醇、過氧化氫（30%）、磷酸鹽緩沖液 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

THD-2010A超聲波發(fā)生器 深圳市太和達科技有限公司；2.0 EL型冷凍干燥機 美國Virtis公司；XT H 225 LC型工業(yè)X射線計算機斷層掃描系統(tǒng)（X-ray computed tomography，X-CT） 日本尼康公司；722S型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；LyoResis共晶點測試儀 北京海博飛科技有限公司；34970A型數(shù)據(jù)采集儀 美國Agilent公司；AZ-8402型便攜式溶氧儀 臺灣衡欣科技股份有限公司；BT125D型電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；西林瓶（7 mL） 寧波正力藥品包裝有限公司；溶液過濾器（0.22 μm） 天津亳津科技有限公司。

圖 1 超聲輔助凍結裝置Fig. 1 of the ultrasonic assisted freezing device

超聲波輔助凍結裝置如圖1所示，由超聲波發(fā)生器（29 kHz）、2 個超聲振子（60 W）、不銹鋼平板（200 mm×200 mm×1.5 mm）組成。首先用鋁箔法確定超聲波系統(tǒng)中空化作用強烈的區(qū)域，然后在此區(qū)域增加緊固西林瓶的擋板，實驗時將西林瓶置于兩個擋板中間（為了防止西林瓶在超聲振動時滑動、跳起）；溫度檢測系統(tǒng)由T型熱電偶、數(shù)據(jù)采集儀和計算機組成。實驗時將超聲波輔助凍結系統(tǒng)直接置于凍干機擱板上固定位置處。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

選取CAT作為模式蛋白，配制1 mg/mL的CAT溶液于磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）中，依次加入質(zhì)量分數(shù)10%的蔗糖溶液（冷凍保護劑）、質(zhì)量分數(shù)10%的甘露醇溶液（賦形劑）。CAT溶液配制好后用0.22 μm孔徑的過濾器過濾，用移液槍吸取3 mL CAT溶液移入西林瓶中。5 種溶氧水平的溶液通過以下方法獲取。

低溶氧水平：溶氧量為4.10 mg/L。將配制好的CAT溶液置于凍干機真空室中，控制真空室壓力為10 kPa，擱板溫度設置為4 ℃（防止酶過度失活），進行真空脫氣8 h。

較低溶氧水平：溶氧量為6.36 mg/L。將配制好的CAT溶液置于凍干機真空室中，控制真空室壓力為10 kPa，擱板溫度設置為4 ℃，進行真空脫氣4 h。

平衡溶氧水平：溶氧量為8.45 mg/L。將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫待用。

較高溶氧水平：溶氧量為10.24 mg/L。將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫至4 ℃后，實驗前直接注入壓縮空氣，使溶氧量達到10.24 mg/L時停止注入。

高溶氧水平：溶氧量為13.44 mg/L。將配制好的CAT溶液直接注入壓縮空氣，使溶氧量達到13.44 mg/L時停止注入，用液氮快速冷卻但不要凍結。

1.3.2 CAT溶液共晶點與共熔點的測定

取20 mL CAT溶液于燒杯中，把燒杯放置在凍干機擱板上，將共晶點測試儀的電極和熱電偶插入溶液中心位置處，開啟凍干機壓縮機降溫至-50 ℃，記錄數(shù)據(jù)；當CAT溶液降溫至-50 ℃時，設置凍干機擱板溫度為0 ℃并開始升溫。根據(jù)共晶點測試儀記錄的溫度曲線和電阻曲線讀取CAT溶液的共晶點為-31.5～-25.5 ℃，共熔點為-27.5～-22.7 ℃；一般預凍溫度低于共晶點溫度5～10 ℃，因此預凍溫度選擇為-40 ℃，一次干燥溫度略低于共熔點溫度，因此選擇一次干燥溫度為-30 ℃。

1.3.3 CAT溶液成核溫度的確定

將超聲波平板放置于凍干機擱板上，開啟凍干機，控制凍干機冷腔和超聲平板溫度至4 ℃后，用移液槍將控制好溶氧量的CAT溶液移取3 mL至西林瓶中，把西林瓶放置于兩個擋板中間，熱電偶插入溶液幾何中心位置處。關閉冷腔艙門，設置擱板溫度為-40 ℃，讓凍干機擱板與超聲波平板從4 ℃開始降溫。開啟溫度采集系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集儀每隔1 s采集一次溫度。當CAT溶液溫度降至-1 ℃時，開啟超聲功率為0.26 W/cm2的超聲波5 s；若未見成核現(xiàn)象，溫度每降低1 ℃施加5 s超聲波，直至CAT溶液成核，根據(jù)凍結曲線尋找各個溶氧量下CAT溶液的最大超聲波觸發(fā)成核溫度。另取平衡溶氧水平的CAT溶液（8.45 mg/L）進行自發(fā)成核并冷凍干燥為對照實驗。

1.3.4 超聲波輔助冷凍干燥

對不同溶氧水平的CAT溶液按照上述確定的最大超聲波觸發(fā)成核溫度進行控制成核，超聲波觸發(fā)成核后取出熱電偶，溶液繼續(xù)冷凍至-40 ℃，取出超聲波平板，讓溶液在-40 ℃的凍干機擱板上低溫保持2 h。設置擱板溫度-30 ℃、壓力10 Pa，每隔2 h取出稱質(zhì)量。當凍干溶液的水分質(zhì)量分數(shù)降至10%以下時轉(zhuǎn)為二次干燥，設置擱板溫度10 ℃，壓力10 Pa。每隔2 h取出稱質(zhì)量，當凍干溶液水分質(zhì)量分數(shù)降至5%以下時，干燥結束。干燥結束后進行真空包裝，待用。根據(jù)每隔2 h稱的樣品質(zhì)量，計算其水分質(zhì)量分數(shù)，并繪制水分質(zhì)量分數(shù)曲線，升華干燥階段的時間可由水分質(zhì)量分數(shù)曲線讀取。

1.3.5 孔隙率的測定

凍干樣品中孔隙的形態(tài)可以看作是樣品在之前冷凍過程中所形成的冰晶的形態(tài)，是一種研究結晶過程較為常用的方法[22-24]。首先將潔凈的西林瓶置于X-CT載物臺上，調(diào)整西林瓶位置后校正灰度；將帶瓶凍干餅放入工業(yè)X-CT機進行掃描。X射線掃描電壓為72 kV，掃描電流為140 μA。曝光時間為500 ms、拍攝張數(shù)為1 800 張，即掃描結束將有1 800 張二維平面（2D）掃描圖；利用3CT Pro 3D軟件合成三維立體（3D）圖形，將2D掃描圖重構組成3D圖像模型；利用VGStudio MAX 2.2分析軟件對3D圖像模型進行分析；在模型中選取出一個直徑5 mm、高度5 mm的圓柱體，定義為一個研究區(qū)域（region of interest，ROI）；將ROI放大，直至可以區(qū)分凍干餅固體與空氣的邊界，定義孔隙的邊界；通過VGStudio MAX 2.2分析軟件，統(tǒng)計計算得出一個ROI的孔隙率；凍干餅的孔隙率由3個ROI的孔隙率的平均值求得。

1.3.6 酶活力回收率的測定

CAT活力的測定方法以Beers and Sizers法[25]為基礎進行一定改進。首先在每組含凍干樣品的西林瓶中加入3 mL過濾后的純水復水，然后將此復水后的CAT溶液放入25℃水浴鍋中恒溫待用。以pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液為空白對照，在3 mL比色皿中加入2.9 mL、體積分數(shù)2%過氧化氫，再取復水后的CAT溶液0.1 mL加入其中，記錄240 nm波長處吸光度從0.45到0.40的時間（T），同時測定冷凍干燥前的CAT溶液吸光度從0.45到0.40的時間（T0）。各溶氧水平的CAT溶液凍干前后都要分別測定。酶活力回收率計算方式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復3 次，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)作圖，并用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗，分析不同組間的差異性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥速率的影響

表 1 不同溶氧量CAT溶液的超聲波控制成核參數(shù)和成核后的升華干燥時間Table 1 Ultrasonic control nucleation parameters of CAT solutions with different dissolved oxygen contents and sublimation drying time after nucleation

由表1可知，溶氧量越高，最大超聲波觸發(fā)成核溫度越高。平衡溶氧水平的CAT溶液（8.45 mg/L）在超聲波控制成核后的升華干燥時間是26.81 h，比對照組縮短了21.05%；而溶氧量高的CAT溶液（10.24、13.44 mg/L）在超聲波控制成核后的升華冷凍干燥時間分別比對照組縮短了32.98%、41.63%；溶氧量低的CAT溶液（4.10、6.36 mg/L）在超聲波控制成核后的升華干燥時間分別縮短了9.36%、12.98%。這說明了在4.10～13.44 mg/L溶氧范圍內(nèi)，超聲波控制成核后CAT溶液的冰晶尺寸增大，因而都能加快溶液的冷凍干燥速率，且提高溶液中溶氧量可以大幅度縮短升華干燥時間。

2.2 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥過程中水分質(zhì)量分數(shù)的影響

圖 2 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核在升華干燥過程中的水分質(zhì)量分數(shù)Fig. 2 Water contents of CAT solution with different dissolved oxygen contents during ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying process

由圖2可以看出，經(jīng)超聲波控制成核后，各溶氧量CAT溶液的水分質(zhì)量分數(shù)曲線明顯都在對照組的下方，由于對照組形成的冰晶較小，升華后干燥層阻力較大；因此相較于經(jīng)超聲波控制成核后的各溶氧量CAT溶液，其升華干燥后期階段的干燥速率較小，干燥時間較長。此外，經(jīng)過相同干燥時間，CAT溶液的溶氧量越高，其水分質(zhì)量分數(shù)越低，干燥速率越大。溶氧量為10.24、13.44 mg/L的CAT溶液，在升華干燥階段的前2 h內(nèi)，它們的干燥速率與對照組并未出現(xiàn)顯著差異，隨著干燥時間的延長，其干燥速率顯著大于對照組。溶氧量為4.10、6.36、8.45 mg/L的CAT溶液，在干燥階段的前4 h內(nèi)，它們的干燥速率與對照組沒有顯著差異；而溶氧量為4.10 mg/L的CAT溶液，它的干燥速率與對照組在前12 h內(nèi)沒有顯著差異，隨著干燥時間的延長，其干燥速率顯著大于對照組?？偟貋碚f，在4.10～13.44 mg/L的溶氧范圍內(nèi)，溶氧量越高，干燥速率越大。

2.3 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥后孔隙率的影響

溶液凍結過程中水固化成冰，冰晶升華后留下孔隙，研究孔隙的大小和分布可以反映凍結過程中冰晶固化的規(guī)律，同時孔隙大小和分布可以直接影響多孔物料中的傳質(zhì)過程，從而影響干燥速率[26]。由圖3可知，隨著CAT溶液中溶氧量的增加，凍干后的孔隙率逐漸增大，但這種規(guī)律并不呈線性關系，溶氧量從4.10 mg/L增加到6.36 mg/L時孔隙率增加不明顯，而溶氧量從8.45 mg/L增加到13.44 mg/L時孔隙率顯著增加。張三強等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，溶液中的初始溶氧量會對超聲波控制成核形成的冰晶產(chǎn)生影響，進而影響隨后的凍干過程。4.10、6.36 mg/L這兩種溶氧量CAT溶液的孔隙率略大于對照組，經(jīng)過顯著性分析，它們的孔隙率與對照組無顯著差異。8.45、10.24、13.44 mg/L這3 種溶氧量的CAT溶液在凍干后的孔隙率明顯大于對照組，它們的孔隙率分別提高了28.53%、64.18%、80.11%；這是因為超聲波在較高成核溫度下觸發(fā)形成的晶核能夠生長成較大的冰晶，冰晶升華后可以形成較大的孔隙，因此凍干后形成的孔隙率也較大。而充氣后CAT溶液（溶氧量為10.24、13.44 mg/L）的孔隙率要遠大于平衡溶氧水平CAT溶液（溶氧量為8.45 mg/L）的孔隙率，說明了充氣可以大幅提高孔隙率，進而提高干燥速率。

圖 3 不同溶氧量CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的孔隙率Fig. 3 Porosity of CAT solution with different dissolved oxygen contents during ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying process

2.4 不同溶氧量下超聲波控制CAT溶液成核對升華干燥后酶活力回收率的影響

圖 4 不同溶氧量CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率Fig. 4 Enzyme activity recovery of CAT solution with different dissolved oxygen contents after ultrasonic controlled nucleation and sublimation drying

由圖4可知，4.10、6.36、8.45、10.24 mg/L這4 種溶氧量的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率都高于95%，與對照組相比酶活力沒有損失。而溶氧量為13.44 mg/L的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率僅為83.3%，這可能一方面是因為該溶氧量下CAT溶液的最大超聲波觸發(fā)成核溫度高（（-1.29±0.11）℃），溶液凍結過程中相變時間長，溶質(zhì)存在濃縮現(xiàn)象損傷了酶活力；另一方面在較高溫度下功率超聲波的空化效應比較劇烈，產(chǎn)生的瞬時高溫（＞5 000 K）、高壓（100 MPa）和高能沖擊波（約108N/m2）[28-29]都會對CAT的蛋白分子構象產(chǎn)生不利影響，進而造成酶活力的損失。溶氧量為4.10、6.36 mg/L的CAT溶液經(jīng)超聲波控制成核升華干燥后的酶活力回收率要顯著高于對照組，這可能是因為脫氣后溶液中的溶氧量及氣泡減少，空氣在溶液凍結和升華干燥過程中對酶活力造成的損失降低了，而且超聲作用對酶活力有激發(fā)的效果[30]。

3 結 論

本研究對不同溶氧量的CAT溶液進行超聲波控制成核并冷凍干燥，考察溶液充氣法用于超聲波控制成核在升華干燥速率、孔隙率、酶活力回收率方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在4.10～13.44 mg/L的溶氧范圍內(nèi)對CAT溶液采用超聲波控制成核，隨著溶液中溶氧量的增加，最大超聲波觸發(fā)成核溫度提高，凍結后形成的冰晶尺寸增大，冷凍干燥速率加快，但溶氧量過高會降低酶活力回收率。綜上所述，超聲波控制成核輔助凍干時，在一定范圍內(nèi)能提高溶液含氣量，不僅可以縮短升華干燥時間，降低真空冷凍干燥的能耗，而且對凍干物品的質(zhì)量沒有顯著影響；顯示了充氣法用于功率超聲波控制成核對冷凍干燥技術的積極意義。