黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果及對α-淀粉酶活性的抑制作用

徐艷陽，仇 洋，王君旸，張鐵華,*，顏偉強，史成軍

（1.吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.匯能生物科技（江蘇）有限公司，江蘇 洪澤 223100；3.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）系薔薇科腺肋花楸屬，是一種甜酸略帶澀味的紫黑色漿果。黑果腺肋花楸樹高0.5～3.0 m，樹形呈叢狀[1]，鮮果產(chǎn)量達到10～15 t/hm2。黑果腺肋花楸原產(chǎn)于美國東北部，后傳入歐洲[2-3]，近年來在中國、朝鮮、俄羅斯、加拿大、波蘭等國家均有廣泛栽培[4]，且品種已達30余個[5]。20世紀90年代初期，我國遼寧省干旱地區(qū)造林研究所從國外先后引進8 個品種[6]。2001年以后，黑果腺肋花楸已被推廣到我國內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、河南、河北、山東、新疆等12 個省，引種推廣面積達到120 hm2[7-8]。黑果腺肋花楸果實中富含多酚、有機酸、三萜、甾醇、原花青素、花色苷、槲皮素、酚酸等活性成分以及還原糖、維生素、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分。現(xiàn)有研究表明，黑果腺肋花楸具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、預防尿路感染、保護肝臟、降血糖、降血脂及防治心腦血管疾病等諸多生理功能。黑果腺肋花楸果實中多酚類物質(zhì)總含量多達2.5%～3.5%[9]，屬于一種天然的多酚類活性物質(zhì)，主要包括原花青素、花色苷、類黃酮、酚酸等[10]，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降糖降脂、抗突變、抗菌以及治療肥胖疾病等功效。黑果腺肋花楸資源豐富、經(jīng)濟價值高，是集食用、藥用及保健等價值于一身的珍貴品種[5]。

黑果腺肋花楸中活性成分的功能性研究始于20世紀80年代，國外對其功能性研究主要集中在清除自由基能力等抗氧化活性和對人體代謝的影響等方面，而國內(nèi)對功能性的研究則相對落后。Br?unlich等[11]通過研究黑果腺肋花楸提取物、亞組分及其化合物對防止生物膜形成及抑制大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌在體外生長的能力，發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸提取物中某些組分具有抗生物膜活性的作用。Denev等[12]研究了黑果腺肋花楸果葉提取物對大腸桿菌、李斯特菌和白色念珠菌等11 種人體病原菌的抑制活性，結果表明黑果腺肋花楸果葉提取物對金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌均有抑制作用。Worsztynowicz等[13]研究得出黑果腺肋花楸中綠原酸是胰腺α-淀粉酶最有效的抑制劑，矢車菊素-3-葡萄糖苷能夠有效抑制胰腺α-淀粉酶和脂肪酶的催化反應。但關于黑果腺肋花楸抑菌活性的研究報道甚少[14-15]。本研究對黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果以及對α-淀粉酶的抑制作用進行探究，旨在為黑果腺肋花楸多酚在食品中作為兼具降脂功能的天然抗氧化劑，及黑果腺肋花楸資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

黑果腺肋花楸凍果由延邊黑果科技發(fā)展有限公司提供。

大腸桿菌（Escherichia coli）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、米根霉（Rhinpus oryzac）、島青霉（Penicillium islandicum）、康寧木霉（Trichoderma koningii），均由吉林大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

苯酚、二水磷酸二氫鈉、氯化鈉、葡萄糖、氫氧化鈉、十二水磷酸氫二鈉、無水亞硫酸鈉（均為分析純）北京化工廠；酒石酸鉀鈉（分析純） 天津市光復精細化工研究所；可溶性淀粉（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；氯霉素（分析純） 北京鼎國生物技術有限公司；α-淀粉酶、蛋白胨、牛肉膏（均為生物純）北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂（生物純） 海南省瓊海長坡瓊青瓊脂廠；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；阿卡波糖片 拜耳醫(yī)藥保健有限公司；Folin-Ciocalteus試劑為吉林大學食品科學與工程學院實驗室自制。

細菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）的制備：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入瓊脂15～20 g，溶解后于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，備用。

真菌培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）的制備：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂15～20 g，自然pH值，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，備用。

DNS試劑的配制：參考文獻[16]中方法。

酶溶液的配制：參考文獻[17]中方法配制磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）。將α-淀粉酶溶于磷酸鹽緩沖液中，配成不同質(zhì)量濃度的α-淀粉酶溶液。

1.2 儀器與設備

101A-1ET電熱鼓風干燥箱、DHP060恒溫培養(yǎng)箱上海實驗儀器廠有限公司；AL104型電子分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DSX-280A不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；FD-1C-80冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；PB-10 pH計德國賽多利斯集團；RE-52-99旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器 金壇市恒豐儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SW-CJ-1DF潔凈工作臺 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-4802型紫外-可見分光光度計尤尼科（上海）儀器有限公司；游標卡尺 哈爾濱量具刃具集團有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸多酚的提取與純化

黑果腺肋花楸凍果經(jīng)室溫解凍，清洗榨汁，果渣烘干，粉碎過60 目篩，在硫酸銨質(zhì)量濃度0.324 g/mL、醇-水體積比0.69∶1、超聲時間52 min、超聲功率200 W條件下進行超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取黑果腺肋花楸果渣中多酚[18]，經(jīng)離心、減壓濃縮（45 ℃）得到黑果腺肋花楸多酚粗提液。在進樣液質(zhì)量濃度4.64 mg/mL、自然pH值、進樣體積6.0柱體積（bed volume，BV）、進樣流速1.0 mL/min、乙醇體積分數(shù)60%、洗脫流速0.5 mL/min、洗脫體積2.5 BV條件下，采用HPD-600樹脂對黑果腺肋花楸多酚粗提物進行分離純化得到黑果腺肋花楸多酚純化液（純度為76.90%）[19-20]。再經(jīng)冷凍干燥得到黑果腺肋花楸多酚凍干粉，置于干燥環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 供試菌種的活化與菌懸液的制備

在潔凈工作臺上，將7 種供試菌用平板劃線法接種在相應的新鮮試管斜面培養(yǎng)基上，每個供試菌接種3 支試管，細菌放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h，霉菌放于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h。供試菌種按上述方法反復活化3 次，制成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.3 黑果腺肋花楸多酚抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果。在潔凈工作臺上，每個無菌培養(yǎng)皿中加入0.2 mL適宜濃度的菌懸液，將滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻至45 ℃后傾注于培養(yǎng)皿中，每皿約15 mL，充分混勻，待凝固后制成含菌平板。將無菌濾紙片分別放入不同質(zhì)量濃度（5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mg/mL）的黑果腺肋花楸多酚純化液和無菌蒸餾水中浸泡15 min，充分吸收后取出并吸干多余溶液。每皿均勻分貼同種濾紙片3 片，空白對照濾紙片1 片，重復3 組。細菌置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，霉菌置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。

用2 倍稀釋法將黑果腺肋花楸多酚純化液稀釋至0.171 9～11.000 0 mg/mL 7 個質(zhì)量濃度梯度以測定最低抑菌濃度。按上述方法重復2 組進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后，以完全無細菌生長的最低樣液質(zhì)量濃度作為最低抑菌濃度。

1.3.4 pH值對黑果腺肋花楸多酚抑菌活性的影響

將質(zhì)量濃度為13.0 mg/mL黑果腺肋花楸多酚純化液分別置于不同pH值（3.0、5.0、7.0、9.0、11.0）條件下處理30 min，另取未處理的樣品作空白對照，以金黃色葡萄球菌、煙曲霉為指示菌，按照1.3.3節(jié)中方法進行抑菌實驗。

1.3.5 α-淀粉酶活力的測定

參考Udupa等[21]的方法測定α-淀粉酶活力，并略作改動。將一定量的α-淀粉酶溶液置于比色管中，37 ℃條件下水浴15 min后，加入0.2 mL底物溶液（已預熱至37 ℃），反應一定時間后，加入1.0 mL DNS試劑終止反應，并置于沸水浴中5 min，迅速冷卻，加入3 mL蒸餾水稀釋，于540 nm波長處測定吸光度。以磷酸鹽緩沖液替代酶溶液作空白對照。

1.3.6 酶反應動力學的研究

通過改變反應體系中加入的α-淀粉酶溶液（0.02 mg/mL）體積，按照1.3.5節(jié)中方法，酶促反應開始時，每隔1 min加入1.0 mL DNS試劑終止反應，混合后置于沸水浴中5 min，迅速冷卻，加入3 mL蒸餾水稀釋，測定吸光度A540nm。

1.3.7 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制效果

將0.1 mL 0.02 mg/mL α-淀粉酶溶液置于試管中，分別加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度的黑果腺肋花楸多酚純化液，37 ℃條件下水浴15 min后，加入0.2 mL底物溶液（已預熱至37 ℃），反應3 min后，加入1.0 mL DNS試劑終止反應，并置于沸水浴中5 min，迅速冷卻，加入3 mL蒸餾水稀釋，在540 nm波長處測定吸光度。以磷酸鹽緩沖液替代酶溶液作空白對照，阿卡波糖作陽性對照，每組實驗重復3 次。按照下式計算黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制率。

式中：A1、A2、A3分別為540 nm波長處空白對照、抑制劑管和背景對照的吸光度。

1.3.8 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制機理

選擇底物質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，黑果腺肋花楸多酚純化液質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL，在α-淀粉酶濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL條件下，按照1.3.7節(jié)中方法測定吸光度A540nm，并計算反應初始速率。以酶質(zhì)量濃度為橫坐標，反應初始速率為縱坐標作圖，根據(jù)動力學圖的特征判斷黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制類型。

選擇酶質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL，黑果腺肋花楸多酚純化液質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL，在不同的底物質(zhì)量濃度（0.5 g/100 mL和1.0 g/100 mL）下，按照1.3.7節(jié)中方法測定吸光度A540nm，并計算反應初始速率。以抑制劑質(zhì)量濃度為橫坐標，反應初始速率的倒數(shù)為縱坐標作圖，判斷其具體抑制類型。

1.3.9 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶光譜性質(zhì)的影響

移取2.5 mL 0.02 mg/mL α-淀粉酶溶液于石英比色皿中，掃描190～400 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。掃描完畢后，用移液器移取不同體積的黑果腺肋花楸多酚純化液（0.30 mg/mL）于石英比色皿中，混勻后掃描190～400 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，得到不同體積的黑果腺肋花楸多酚純化液與α-淀粉酶溶液相互作用后的紫外吸收光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運用Microcal Origin 7.5軟件進行圖表的繪制和相關數(shù)據(jù)的處理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析及鄧肯氏多重比較分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果

2.1.1 黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果分析

通過測定抑菌圈直徑大小評價黑果腺肋花楸多酚對不同供試菌的抑制作用，實驗結果見表1。

表 1 黑果腺肋花楸多酚的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effect of Aronia melanocarpa polyphenols

以抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感、10～15 mm為中度敏感、6～10 mm為低度敏感[22-23]。由表1可以看出，黑果腺肋花楸多酚對7 種供試菌均有一定的抑制作用，并且對霉菌的抑制效果強于對細菌的抑制效果。對于細菌而言，黑果腺肋花楸多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果均隨其質(zhì)量濃度的增大而加強。黑果腺肋花楸多酚對金黃色葡萄球菌的抑制效果略強于大腸桿菌，這一結果與蘋果多酚的抑菌效果相似[24]。對于霉菌而言，黑果腺肋花楸多酚對煙曲霉的抑制作用最強。當多酚純化液的質(zhì)量濃度增加到13.0 mg/mL時，兩種細菌對黑果腺肋花楸多酚均表現(xiàn)出低度敏感（抑菌圈直徑處于6～10 mm之間），而煙曲霉對黑果腺肋花楸多酚則表現(xiàn)出中度敏感（抑菌圈直徑處于10～15 mm之間）。綜上所述，選擇金黃色葡萄球菌和煙曲霉作為進一步研究的對象，其抑菌效果如圖1所示。

圖 1 黑果腺肋花楸多酚對金黃色葡萄球菌（A）和煙曲霉（B）的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of Aronia melanocarpa polyphenols on Staphylococcus aureus (A) and Aspergillus fumigatus (B)

2.1.2 pH值對黑果腺肋花楸多酚抑菌活性的影響

從圖2可以看出，黑果腺肋花楸多酚在pH 3.0～11.0條件下均具有抑菌活性。對于金黃色葡萄球菌而言，抑菌圈直徑隨pH值的升高先變大后減小，在酸性條件下的抑菌效果比堿性條件下更強，當pH＞7.0時，抑菌活性較對照組有所降低。這可能是因為黑果腺肋花楸多酚在自然情況下屬于酸性物質(zhì)，在堿性環(huán)境中其結構易受到破壞而引起抑菌效果的減弱。對于煙曲霉而言，隨著pH值的升高，抑菌圈直徑呈先變大后減小再變大的趨勢，抑菌活性較對照組均有降低，具體原因有待于進一步探索。通過方差分析可得，pH值對金黃色葡萄球菌和煙曲霉的抑制效果影響均顯著（P＜0.05）。綜上所述，在pH 5.0時，黑果腺肋花楸多酚對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，而對于煙曲霉，pH值的變化對抑菌效果有破壞作用。

2.1.3 最低抑菌濃度的測定結果

由表2可以看出，黑果腺肋花楸多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為2.750 0 mg/mL，對康寧木霉的最低抑菌濃度為1.375 0 mg/mL，對黃曲霉、米根霉、島青霉的最低抑菌濃度為0.687 5 mg/mL，對煙曲霉的最低抑菌濃度為0.171 9 mg/mL，陰性對照組無抑菌現(xiàn)象。

2.2 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用

2.2.1 酶反應動力學的研究結果

通過酶反應動力學實驗確定最適酶量為0.1 mL，反應時間為3 min。

由Lineweaver-Burk曲線，可得到米氏常數(shù)Km為0.995 mg/mL，最大反應速率vmax為0.158 min-1。

2.2.2 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制效果

分別測定黑果腺肋花楸多酚和阿卡波糖在0.10～0.70 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對α-淀粉酶活性的抑制作用。由圖3可知，隨著黑果腺肋花楸多酚質(zhì)量濃度的增加，抑制率先增大后趨于平緩。在研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用強于等質(zhì)量濃度的阿卡波糖。

圖 3 黑果腺肋花楸多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制活性Fig. 3 Inhibitory activity of Aronia melanocarpa polyphenols and acarbose on α-amylase

2.2.3 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制類型

根據(jù)酶與抑制劑的結合方式及抑制作用是否可逆，可將抑制類型分為可逆性抑制和不可逆性抑制。可逆性抑制是指抑制劑與酶通過非共價鍵結合，去除抑制劑后酶活性可以恢復；不可逆性抑制是指抑制劑與酶通過共價鍵結合引起酶失活，又被稱為酶的修飾抑制[25]。由圖4可以看出，未添加黑果腺肋花楸多酚溶液時，反應初始速率對酶質(zhì)量濃度作圖得到一條過原點的直線；當加入一定量黑果腺肋花楸多酚溶液后，由于抑制劑的量是恒定的，同樣得到一條通過原點的直線，但斜率低于無抑制劑組直線的斜率。由此推斷出黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制類型為可逆性抑制。

圖 4 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制動力學曲線Fig. 4 Kinetic curve of Aronia melanocarpa polyphenols for the inhibition of α-amylase

2.2.4 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的可逆性抑制類型

根據(jù)抑制劑、酶和底物三者之間的關系，可逆性抑制分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制3 種類型[26]。以抑制劑質(zhì)量濃度為橫坐標，1/v為縱坐標作圖，不同底物質(zhì)量濃度對應的直線相交但不交于橫坐標軸時，屬于競爭性抑制；交于橫坐標軸時，屬于非競爭性抑制；平行則屬于反競爭性抑制。抑制常數(shù)Ki為交點對應的抑制劑濃度[27]。由圖5可知，黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的可逆抑制類型屬于非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki為0.193 2 mg/mL。

圖 5 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的可逆抑制類型Fig. 5 Reversible inhibition type of Aronia melanocarpa polyphenols on α-amylase

2.2.5 黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶光譜性質(zhì)的影響

α-淀粉酶溶液在190～400 nm范圍內(nèi)存在202 nm與279 nm波長處2 個較大的吸收峰，由于202 nm波長處的波譜產(chǎn)生跳躍，影響比較結果，故選定190～250 nm作為考察范圍，研究加入不同量黑果腺肋花楸多酚與α-淀粉酶溶液作用后的紫外吸收光譜。從圖6中可以看出，在202 nm波長附近，吸光度隨著黑果腺肋花楸多酚純化液的加入而不斷增加，最大吸收波長出現(xiàn)紅移現(xiàn)象。這是因為黑果腺肋花楸多酚純化液促進了酶構象發(fā)生變化，從而影響吸光度和吸收峰的變化[28]。繼續(xù)增大黑果腺肋花楸多酚純化液的加入量，紫外吸收峰的增幅逐漸變小，表明此時抑制劑與α-淀粉酶的相互作用已趨于平衡。

圖 6 不同加入量抑制劑處理后α-淀粉酶的紫外吸收光譜Fig. 6 Ultraviolet absorption spectra of α-amylase with different amounts of added inhibitor

3 結 論

通過濾紙片法發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、煙曲霉、米根霉、島青霉、康寧木霉均有一定的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌，對煙曲霉的抑制效果最強，最低抑制濃度為0.171 9 mg/mL；在pH 5.0條件下，黑果腺肋花楸多酚對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，而對于煙曲霉，處理溫度和pH值的變化對抑菌效果均有破壞作用。通過研究黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性的抑制動力學特性，表明黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶具有顯著的抑制作用，并且在0.10～0.70 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶的抑制活性強于陽性對照阿卡波糖；黑果腺肋花楸多酚對α-淀粉酶活性屬于可逆非競爭性抑制，抑制常數(shù)為0.193 2 mg/mL。在202 nm波長處，黑果腺肋花楸多酚能夠引起α-淀粉酶紫外吸收的增強和吸收峰的紅移。本研究初步證實黑果腺肋花楸多酚對多種菌及α-淀粉酶活性具有一定的抑制作用，黑果腺肋花楸多酚可作為兼具防腐抑菌功能的α-淀粉酶抑制劑應用于食品、藥品防腐保鮮中，同時也為黑果腺肋花楸資源的開發(fā)利用提供參考。