燕麥萌發(fā)耐鹽性及指標(biāo)篩選

陶 金，侯龍魚，楊 杰,3，宋世環(huán),4，白文明,4， 潘慶民,4，殷淑艷，郝建璽，張文浩,3,4

(1.中國科學(xué)院植物研究所, 植被與環(huán)境變化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100093; 2.呼倫貝爾生態(tài)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008； 3.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100049; 4.中國科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心,北京 100093)

土壤鹽漬化是種植業(yè)生產(chǎn)中僅次于干旱的第二大非生物脅迫因子[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)鹽漬化面積約占地球陸地總面積的6.7%，占我國國土面積的1/3[2]。種子萌發(fā)期是作物能否在鹽脅迫下完成生育周期最為關(guān)鍵的時(shí)期，對鹽脅迫的積極響應(yīng)決定著立苗和后期的生長發(fā)育[3]。因此，研究鹽脅迫下作物種子的萌發(fā)特性具有重要的意義。

燕麥?zhǔn)且环N糧、經(jīng)、飼、藥等多用途植物，生產(chǎn)上主要種植皮燕麥(Avenasativa)和裸燕麥(A.nuda)[1]。傳統(tǒng)上我國主要種植裸燕麥，種植區(qū)域集中在西北、華北和西南的高寒地區(qū)[1]。近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，振興奶業(yè)行動(dòng)，草牧業(yè)理論的提出及實(shí)施，飼草型燕麥品種受到普遍重視，皮燕麥在國內(nèi)種植面積增加迅速[4]。燕麥作為優(yōu)質(zhì)飼草,我國進(jìn)口量由2008年的0.15 萬t增加到2017年的30.81萬t (http://www.xumurc.com/main/ShowNews_57673.html)。傳統(tǒng)上適宜我國燕麥種植的地區(qū)多為鹽堿地集中區(qū)[1]，因此，研究燕麥品種間耐鹽差異以及鹽脅迫下燕麥萌發(fā)幼苗生長特征，對田間生產(chǎn)選擇適宜燕麥品種具有重要的意義。

燕麥品種間耐鹽性在裸燕麥品種間[1,5-6]、皮燕麥品種間[7-10]、皮裸燕麥綜合比較[11-12]時(shí)均有差異。隨著鹽濃度的升高，各品種的發(fā)芽指標(biāo)，如發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長額芽長均呈現(xiàn)規(guī)律性變化[12-13]。此外，也有燕麥品種間的耐鹽生理機(jī)制[12-13]、蛋白組學(xué)等[14]的研究報(bào)道?？寡趸赶到y(tǒng)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等均隨著鹽脅迫濃度的增加有規(guī)律性的改變[12-13]。但是在判定可以準(zhǔn)確指示鹽脅迫條件下的萌發(fā)特征時(shí)存在爭議[1,11-12],如發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的差異[1,11]，以及根長和芽長的耐鹽敏感性[8,11,13]。因此，選擇合適的指示指標(biāo)，準(zhǔn)確評價(jià)鹽脅迫下燕麥的萌發(fā)特征，可以更準(zhǔn)確地比較燕麥品種間的耐鹽性。

隨著皮燕麥品種的引進(jìn)和推廣，國外品種在我國的種植面積逐年遞增。因此，選擇有代表性的引進(jìn)皮燕麥品種，以及國內(nèi)皮燕麥和裸燕麥主要推廣品種，比較品種間的耐鹽性，同時(shí)利用主成分分析法，篩選耐鹽性指示指標(biāo)，為燕麥耐鹽性的比較提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為燕麥田間生產(chǎn)選擇品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)選用10份燕麥品種，其中皮燕麥8份、裸燕麥2份。青海444和青引2號為國內(nèi)主要推廣的燕麥飼草品種，花早2號和壩莜1號為國內(nèi)主要推廣的裸燕麥品種，其他為進(jìn)口的皮燕麥飼草品種。品種、來源及收獲時(shí)間如表1所列。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用分析純NaCl試劑分別配制0、50、100、200 mmol·L-1的鹽溶液作培養(yǎng)液。采用紙上發(fā)芽法，在培養(yǎng)皿(直徑d=150 mm)內(nèi)鋪入3層濾紙，用移液槍吸取14 mL(預(yù)試驗(yàn)證明14 mL為浸透3層濾紙的溶液量)不同濃度的鹽溶液于培養(yǎng)皿內(nèi)，以等量蒸餾水作對照。選取種粒飽滿、大小一致的燕麥種子，每組100粒，各濃度重復(fù)3次。置于賽福智能人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件25 ℃恒溫，每天16 h光照，光照強(qiáng)度150 μmol·(m2·s)-1，相對濕度80%。每天用蒸餾水補(bǔ)充到初始濾紙的浸透水平。胚根為種子長徑1/2時(shí)判定為萌發(fā)。試驗(yàn)中萌發(fā)只統(tǒng)計(jì)正常苗，判定標(biāo)準(zhǔn)參考國際牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程(ISTA)[15]。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，培養(yǎng)7 d后，結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn)。每皿選取10株苗測定芽長和根長。發(fā)芽率(GP)，發(fā)芽指數(shù)(GI)，平均萌發(fā)時(shí)間(MGT)、萌發(fā)整齊性指數(shù)(Z)的計(jì)算均參考文獻(xiàn)[16-17]，按照以下公式計(jì)算：

GP=∑ni/T×100%；

GI=∑ni/ti；

Z=∑Cni,2/N；

Cni,2=ni(ni-1)/2；

N=∑ni(∑ni-1)/2。

式中：ni為第i天種子萌發(fā)的粒數(shù)，T為供試種子總數(shù)，ti為試驗(yàn)開始到第i天的天數(shù)，k為種子萌發(fā)的總天數(shù)。

表1 試驗(yàn)燕麥品種和來源Table 1 Oat varieties and sources

為了消除燕麥種子初始指標(biāo)間的差異性，選擇相對萌發(fā)指數(shù)來評價(jià)各指標(biāo)間的關(guān)系及鹽脅迫下的抑制程度。對照條件下各指標(biāo)為1時(shí)，鹽脅迫下各指標(biāo)的比例即為相對指標(biāo)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

首先比較鹽脅迫對6個(gè)發(fā)芽指標(biāo)的影響，對比分析鹽脅迫濃度下，各個(gè)指標(biāo)的相應(yīng)變化。運(yùn)用相關(guān)分析，比較6個(gè)萌發(fā)指標(biāo)之間的相關(guān)性。運(yùn)用主成分分析篩選6個(gè)指標(biāo)降維并找出代表性的主成分即指示指標(biāo)。然后根據(jù)6個(gè)指標(biāo)對燕麥進(jìn)行聚類分析，得出供試品種鹽脅迫下萌發(fā)的相似性。

以單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小差異顯著法(LSD)在0.05水平上檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。方差分析與多重比較均用SPSS 22.0軟件輔助完成。圖由SigmaPlot 10.0輔助完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對燕麥品種發(fā)芽指標(biāo)影響

鹽脅迫條件下各品種萌發(fā)耐鹽性表現(xiàn)出差異性(圖1)。品種領(lǐng)袖、愛沃、牧王、燕王和青海444發(fā)芽率在0、50、100和200 mmol·L-1鹽溶液間均沒有顯著差異(P>0.05)。NaCl濃度為200 mmol·L-1時(shí)，品種青引2號發(fā)芽率顯著降低(P<0.05)。NaCl濃度為100 mmol·L-1時(shí)，品種貝勒、花早2號和壩莜1號發(fā)芽率受到顯著抑制作用(P<0.05)。NaCl濃度為50 mmol·L-1時(shí)，品種太陽神發(fā)芽率受到顯著抑制作用(P<0.05)(圖1)。

萌發(fā)整齊性指數(shù)反映種子萌發(fā)的整齊程度。整齊性指數(shù)介于0-1，整齊指數(shù)越大，則萌發(fā)越整齊[16-17]。各品種在不同鹽濃度下整齊性指數(shù)變化各異(圖1)。隨著鹽濃度的升高，品種領(lǐng)袖、花早2號和壩莜1號均顯著下降(P<0.05)。品種青海444各濃度間差異不顯著(P>0.05)。其他品種沒有一致的規(guī)律性。兩個(gè)裸燕麥壩莜1號和花早2號均表現(xiàn)出隨鹽濃度增加而下降的規(guī)律，皮燕麥的規(guī)律性較差，這與燕麥萌發(fā)時(shí)間較短有關(guān)，大部分的燕麥在2～4 d內(nèi)就完成萌發(fā)。

平均萌發(fā)時(shí)間指示種子萌發(fā)的速率，萌發(fā)時(shí)間越短，則萌發(fā)越快[17]。隨著鹽濃度的提高，各燕麥品種的平均萌發(fā)時(shí)間均增加(圖1)。與對照相比，NaCl濃度為200 mmol·L-1時(shí)，品種領(lǐng)袖、太陽神和花早2號平均萌發(fā)時(shí)間顯著增加(P<0.05)；NaCl濃度為50 mmol·L-1時(shí)，品種愛沃、貝勒、燕王和青引2號的平均萌發(fā)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

不同小寫字母表示同一品種不同鹽梯度間差異顯著(P<0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference for each variety among different NaCl concentrations at the 0.05 level.

發(fā)芽指數(shù)同樣反映種子萌發(fā)的活力和萌發(fā)速率。發(fā)芽指數(shù)越高，則萌發(fā)越快[17]。除愛沃外，隨著鹽濃度的增加，各品種萌發(fā)指數(shù)均下降(P<0.05)。NaCl濃度在50 mmol·L-1時(shí)，愛沃、牧王和青海444未表現(xiàn)出顯著差異，其他品種發(fā)芽指數(shù)即出現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)。

芽長和根長可指示種子萌發(fā)時(shí)幼苗生長的速率[17]。除青海444和花旱2號 ，隨著鹽濃度的增加，燕麥品種呈現(xiàn)出逐步下降趨勢，說明鹽濃度增加，抑制了芽和根的生長(圖1)。青海444、花早2號在200 mmol·L-1NaCl濃度時(shí)的芽長、100 mmol·L-1NaCl濃度時(shí)的根長顯著下降(P<0.05)，其他品種在50 mmol·L-1NaCl濃度時(shí)的芽長和根長即顯著降低(P<0.05)，說明大部分燕麥品種芽長和根長對NaCl脅迫敏感。

綜合分析，皮燕麥發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、平均萌發(fā)時(shí)間、芽長和根長均表現(xiàn)出較好的耐鹽性，以青海444耐鹽性最好。裸燕麥鹽脅迫下各萌發(fā)指標(biāo)相對較差，以壩莜1號最差。

2.2 鹽脅迫下燕麥萌發(fā)各指標(biāo)的相關(guān)性

種子萌發(fā)各指標(biāo)間既有差別，又相互聯(lián)系。鹽脅迫對各指標(biāo)的影響有著不同程度的差異(圖1)。相關(guān)分析結(jié)果表明，除相對發(fā)芽率和相對萌發(fā)整齊性指數(shù)相關(guān)系數(shù)(r=0.036)不顯著，其他兩兩指標(biāo)均達(dá)到顯著和極顯著水平(表2)。相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)(r=0.724**，P<0.01)、相對發(fā)芽指數(shù)和相對平均萌發(fā)時(shí)間(r=-0.837**，P<0.01)及相對芽長和相對根長(r=0.716**，P<0.01)相關(guān)系數(shù)較大，說明兩兩之間關(guān)系密切。相對平均萌發(fā)時(shí)間與其他5個(gè)指標(biāo)間均為負(fù)顯著相關(guān)。

2.3 鹽脅迫下燕麥各萌發(fā)指標(biāo)主成分分析

由于鹽脅迫下燕麥種子萌發(fā)各指標(biāo)間有密切的相關(guān)性(表2)。因此，采用主成分分析法，通過降維的方法篩選鹽脅迫下燕麥萌發(fā)的指示指標(biāo)。主成分分析結(jié)果表明，前兩個(gè)主成分占到總信息量的78.24%，可用作燕麥萌發(fā)的指示指標(biāo)(表3)。

表2 鹽脅迫下各發(fā)芽指標(biāo)相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of germination indices under salt stress

*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著相關(guān)。

*and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively.

表3 鹽脅迫下發(fā)芽指標(biāo)主成分結(jié)果與分析Table 3 Principal component analysis of germination indices under salt stress

主成分1主要包含相對發(fā)芽指數(shù)、相對平均萌發(fā)時(shí)間、相對芽長和相對根長，故定義為速率綜合指標(biāo)。主成分2主要包括相對發(fā)芽率和相對萌發(fā)整齊性指數(shù)，定義為比率綜合指標(biāo)(表3)。從主成分矢量圖可以看出，平均萌發(fā)時(shí)間和發(fā)芽指數(shù)在主成分1中有顯著的負(fù)相關(guān)性，相對發(fā)芽率和相對萌發(fā)整齊性指數(shù)在兩個(gè)主成分中均有一定量的貢獻(xiàn)(表3，圖2)。

圖2 鹽脅迫下燕麥各萌發(fā)指標(biāo)主成分分析Fig. 2 Correlation analysis of different germination indexes of oats under salt stress

根據(jù)兩個(gè)主成分系統(tǒng)矩陣，可獲得各品種的主成分因子得分公式[18]，如下：

F1=0.597X1+0.485X2+0.930X3-0.892X4+0.819X5+0.821X6；

(1)

F2=0.636X1-0.743X2+0.225X3+0.228X4-0.033X5+0.067X6。

(2)

根據(jù)F1和F2的值，各品種的綜合得分：

F=0.599 65F1+0.182 73F2。

根據(jù)綜合得分，對10個(gè)燕麥品種進(jìn)行耐鹽性排序(表4)，發(fā)現(xiàn)皮燕麥貝勒、青海444和領(lǐng)袖耐鹽性較高，裸燕麥花早2號和壩莜1號耐鹽性較低。整體來看，皮燕麥的耐鹽性普遍高于裸燕麥。

表4 10個(gè)燕麥品種的耐鹽性排序Table 4 Order of salt tolerance for oat cultivars

2.4 高鹽脅迫下燕麥品種的聚類分析

綜合200 mmol·L-1NaCl處理下6個(gè)萌發(fā)指標(biāo)特征，利用系統(tǒng)聚類法得到10個(gè)品種的聚類樹(圖3)。結(jié)果和主成分分析結(jié)果基本一致，鹽脅迫下皮燕麥的各指標(biāo)的變化距離較近。兩個(gè)裸燕麥品種花早2號和壩莜1號差異較大(圖3)。

圖3 200 mmol·L-1 NaCl脅迫下燕麥品種的聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of 10 varieties based on germination indices under 200 mmol·L-1 NaCl stress

3 討論與結(jié)論

3.1 燕麥品種與耐鹽性

在200 mmol·L-1NaCl溶液培養(yǎng)條件下，燕麥種子多數(shù)發(fā)芽指標(biāo)顯著下降，可以作為評價(jià)燕麥品種間耐鹽性的濃度標(biāo)準(zhǔn)。孫仁國[13]用200 mmol·L-1NaCl溶液處理4個(gè)燕麥品種種子，發(fā)現(xiàn)4個(gè)燕麥品種發(fā)芽指標(biāo)均出現(xiàn)顯著下降。對4個(gè)皮燕麥的耐鹽試驗(yàn)也證明200 mmol·L-1顯著改變了品種的所有萌發(fā)指標(biāo)[8]。本研究中，盡管NaCl濃度為200 mmol·L-1時(shí)，皮燕麥發(fā)芽率沒有顯著下降，但發(fā)芽指數(shù)、平均萌發(fā)時(shí)間、根長和芽長等均有顯著的變化。因此，200 mmol·L-1NaCl溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.2%)為燕麥品種種子萌發(fā)耐鹽性篩選濃度的最低標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地比較指標(biāo)間的變化，使發(fā)芽率指標(biāo)在統(tǒng)計(jì)上也達(dá)到顯著性變化，可以適當(dāng)提高燕麥品種萌發(fā)耐鹽篩選濃度，如250 mmol·L-1NaCl。

本研究發(fā)現(xiàn)，皮燕麥的耐鹽性普遍強(qiáng)于裸燕麥。200 mmol·L-1NaCl對皮燕麥發(fā)芽率影響較小，主要降低了發(fā)芽指數(shù)、芽長、根長等活力指標(biāo)。裸燕麥發(fā)芽率和發(fā)芽活力指標(biāo)在50～100 mmol·L-1NaCl時(shí)出現(xiàn)顯著下降，該結(jié)果驗(yàn)證了呂亞慈等[6]的結(jié)論，即壩莜1號發(fā)芽率在0.5%NaCl脅迫下發(fā)芽率和苗高顯著下降。同時(shí)，呂亞慈等[6]研究發(fā)現(xiàn)，壩莜1號和花早2號耐鹽性在其研究的6個(gè)裸燕麥品種中耐鹽性最高。因此，在鹽害程度較高的地區(qū)種植燕麥時(shí)，首選高耐鹽的皮燕麥，選擇裸燕麥時(shí)，為了保證出苗率和保存率，盡可能選擇相對高耐鹽的裸燕麥品種。

3.2 燕麥萌發(fā)耐鹽指標(biāo)的確定

研究結(jié)果表明，燕麥耐鹽指標(biāo)可以分為兩類。一個(gè)是活力綜合指標(biāo)，一個(gè)是發(fā)芽和整齊度指標(biāo)。陳新等[1]對278份燕麥品種的耐鹽分析結(jié)果表明，發(fā)芽率比發(fā)芽勢更穩(wěn)定，武俊英等[11]研究證明也發(fā)芽率是野燕麥萌發(fā)期耐鹽性的主要鑒定指標(biāo)。本研究中，主成分分析結(jié)果表明燕麥發(fā)芽率和整齊度屬于共同的主成分。其他指標(biāo)發(fā)芽指數(shù)、平均萌發(fā)時(shí)間、芽長和根長為活力指標(biāo)，屬于共同的主成分，作為活力綜合指標(biāo)。NaCl對燕麥幼苗生長的影響主要是抑制其根、芽的生長，本研究結(jié)果中，許多品種在50 mmol·L-1NaCl濃度時(shí)根長和芽長即出現(xiàn)顯著下降，而發(fā)芽率還維持在較高的水平。因此，速率綜合指標(biāo)比比率綜合指標(biāo)具有更強(qiáng)的敏感性，建議在鹽脅迫下燕麥的耐鹽評價(jià)時(shí)，首選速率綜合指標(biāo)，其次是比率綜合指標(biāo)。

有研究指出，低鹽濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%約為50 mmol·L-1)可以促進(jìn)一些燕麥品種發(fā)芽率、芽長的生長[10-11]，也有研究指出低鹽濃度對燕麥種子萌發(fā)沒有促進(jìn)作用[10-11]。本研究中花早2號和青海444芽長在50 mmol·L-1NaCl時(shí)顯著高于對照，發(fā)芽率沒有顯著差異(圖1)。一方面品種間的遺傳特征和發(fā)芽率機(jī)制決定了低鹽對生長的促進(jìn)作用，即一定的離子濃度滲入可以激活代謝過程中的某些酶，有利于發(fā)芽產(chǎn)物和合成，促進(jìn)幼苗生長[11]。另一方面，當(dāng)供試種批質(zhì)量較低時(shí)(如發(fā)芽率低于90%)，培養(yǎng)溶液中鈉離子降低了種子內(nèi)外水勢差，緩解低活力的燕麥種子快速吸水傷害，使種子可以進(jìn)行萌發(fā)前的自我修復(fù)，促進(jìn)萌發(fā)和生長[9]，如PEG引發(fā)可以促進(jìn)低活力種子的萌發(fā)和生長[19]。

萌發(fā)整齊性指數(shù)在描述和評價(jià)植物種子萌發(fā)特征中具有重要的作用[15]。隨著鹽濃度的升高，燕麥種子萌發(fā)整齊性指數(shù)規(guī)律性較差，且與發(fā)芽率沒有顯著相關(guān)性，這與其他物種的研究結(jié)果不一致[16]，主要是因?yàn)檠帑湹让劝l(fā)較快的物種，2～4 d內(nèi)即可完成大部分的萌發(fā)，按天統(tǒng)計(jì)頻率相對較低。而且在試驗(yàn)過程中因工作量較大，統(tǒng)計(jì)時(shí)間會(huì)出現(xiàn)一定的偏差，混淆了小時(shí)尺度上燕麥萌發(fā)速率的差異性。因此，用萌發(fā)整齊性指數(shù)評價(jià)燕麥等快速萌發(fā)的物種時(shí)，萌發(fā)種子數(shù)的動(dòng)態(tài)統(tǒng)計(jì)需以小時(shí)為尺度，比如4～12 h。

皮燕麥的耐鹽性普遍強(qiáng)于裸燕麥，鹽脅迫下各萌發(fā)指標(biāo)間的變化趨勢相似度高于裸燕麥。皮燕麥以青海444和貝勒耐鹽性最高，裸燕麥花早2號強(qiáng)于壩莜1號。鹽脅迫下萌發(fā)速率綜合指標(biāo)較比率綜合指標(biāo)更敏感，在評價(jià)鹽脅迫下品種間的耐鹽性時(shí)，首選速率綜合指標(biāo)。